[發明專利]啟動子篩選方法

在審

• 申請號: 202211712414.8
• 申請日: 2022-12-29
• 公開（公告）號: CN115948431A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 陳書元;賀晨濤;姜玉玲;葉國杰;吳振華;王立軍
• 申請（專利權）人: 杭州嘉因生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/113;C12Q1/66
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張柳

本發明涉及生物技術領域，特別涉及啟動子篩選方法。本發明提供了基因元件組合、表達載體以及ITR在啟動子篩選和/或制備兼容AAV包裝的雙熒光素篩選載體中的應用。本發明在傳統雙熒光篩選系統的基礎上，融合AAV包裝系統，可以用一個載體同時實現質粒層面和病毒層面篩選，大大減少了啟動子篩選周期。同時，因為ITR序列具有一定的啟動子和增強子活性，所以加入ITR序列進行啟動子的篩選更加符合基因療法工作的真實情況。本發明在基因療法啟動子篩選、基因表達鑒定上具有很好的應用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及啟動子篩選方法。

背景技術

基因療法是一種通過將治療性遺傳物質轉移到靶細胞來治療某些疾病的方法。近年來，基因治療研究發展迅速，在多種罕見病中表現優異，是一種理想的治療方法。

基因治療的三個要素包括靶細胞、核酸和轉移方法。因此，在基因治療過程中，選擇合適的載體，可控有效的表達，是成功的關鍵。

1)合適的載體：腺相關病毒三質粒表達系統是目前常用的一類AAV載體系統。該套AAV系統包含表達載體、包裝質粒和輔助質粒。其中表達載體是AAV病毒的核心，包含了ITR序列、CMV啟動子，多克隆位點等，用于攜帶外源基因；包裝質粒負責表達AAV病毒的結構蛋白，決定AAV的血清型和組織嗜性。腺相關病毒具有表達滴度高、宿主免疫反應輕微、感染譜廣、安全性高等優勢，成為近年來在基因治療領域應用廣泛的病毒載體之一。

2)可控有效的表達：而可控有效的表達就需要一個特異性高、強度大的啟動子。根據啟動子的表達特征，通常將啟動子分為組成型啟動子、誘導型啟動子以及器官/組織特異性啟動子，這些啟動子各具特色，選擇一種特異性相對更強的啟動子尤為重要。

但傳統的啟動子篩選過程中，不同階段需要用到不同的質粒，使得啟動子篩選的操作繁瑣、周期較長。

發明內容

有鑒于此，本發明提供的啟動子篩選方法，同時實現質粒層面和病毒層面篩選，大大減少了啟動子篩選周期。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了反向末端重復序列在如下方面的應用：

(I)、啟動子篩選；和/或

(II)、制備兼容AAV包裝的雙熒光素篩選載體。

本發明還提供了基因元件組合，包括熒光素酶基因1、熒光素酶基因2和反向末端重復序列，所述熒光素酶基因1與所述熒光素酶基因2不相同；

所述熒光素酶基因1包括螢火蟲熒光素酶；和/或

所述熒光素酶基因2包括海腎熒光素酶。

在本發明的一些具體實施方案中，上述基因元件組合還包括復制起點、啟動子、終止子、嵌合內含子或抗性基因中的一種或多種。

本發明還提供了上述基因元件組合在制備兼容AAV包裝的雙熒光素篩選載體中的應用。

本發明還提供了表達載體，包括上述基因元件組合，以及可接受的其他基因元件。

在本發明的一些具體實施方案中，上述表達載體具有：

(1)、如SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2所示的核苷酸序列；或

(2)、如(1)所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且功能與(1)的相同或相似；或

(3)、與如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

所述多個為2個至300個。

本發明還提供了上述表達載體在制備啟動子篩選的試劑或試劑盒中的應用。