[發(fā)明專利]啟動子篩選方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211712414.8
• 申請日: 2022-12-29
• 公開（公告）號: CN115948431A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設計）人: 陳書元;賀晨濤;姜玉玲;葉國杰;吳振華;王立軍
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州嘉因生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/113;C12Q1/66
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 張柳

1.反向末端重復序列在如下方面的應用：

(I)、啟動子篩選；和/或

(II)、制備兼容AAV包裝的雙熒光素篩選載體。

2.基因元件組合，其特征在于，包括熒光素酶基因1、熒光素酶基因2和反向末端重復序列，所述熒光素酶基因1與所述熒光素酶基因2不相同；

所述熒光素酶基因1包括螢火蟲熒光素酶；和/或

所述熒光素酶基因2包括海腎熒光素酶。

3.如權(quán)利要求2所述的基因元件組合，其特征在于，還包括復制起點、啟動子、終止子、嵌合內(nèi)含子或抗性基因中的一種或多種。

4.如權(quán)利要求2或3所述的基因元件組合在制備兼容AAV包裝的雙熒光素篩選載體中的應用。

5.表達載體，其特征在于，包括如權(quán)利要求2或3所述的基因元件組合，以及可接受的其他基因元件。

6.如權(quán)利要求5所述的表達載體，其特征在于，具有：

(1)、如SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2所示的核苷酸序列；或

(2)、如(1)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且功能與(1)的相同或相似；或

(3)、與如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

所述多個為2個至300個。

7.如權(quán)利要求5或6所述的表達載體在制備啟動子篩選的試劑或試劑盒中的應用。

8.啟動子的篩選方法，其特征在于，基于如權(quán)利要求5或6所述的表達載體進行篩選；

所述篩選包括：

(i)、通過雙熒光素篩選方法進行篩選；和/或

(ii)、通過包裝為AAV進行動物實驗的方式進行篩選。

9.如權(quán)利要求8所述的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟(A)：以待測啟動子替換如權(quán)利要求5或6所述的表達載體中的啟動子，獲得待測表達載體；

步驟(B)：將步驟(A)所述待測表達載體轉(zhuǎn)染至細胞，培養(yǎng)，進行雙熒光素酶檢測，獲得檢測結(jié)果1；

步驟(C)：取步驟(A)所述待測表達載體、AAV包裝質(zhì)粒和AAV輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞，培養(yǎng)，獲得病毒液，取所述病毒液施用于實驗動物，對所述實驗動物進行活體成像，獲得檢測結(jié)果2；

步驟(D)：根據(jù)步驟(B)所述檢測結(jié)果1和步驟(C)所述檢測結(jié)果2，比較不同所述待測表達載體的表達量，獲得優(yōu)選啟動子，達到篩選的目的。

10.如權(quán)利要求9所述的篩選方法，其特征在于，步驟(A)所述的替換包括通過雙酶切的方法替換，其中，酶切位點為MluI和BamHI。