[發明專利]一種生產白喉毒素無毒突變蛋白的方法及其使用的特異DNA分子

在審

• 申請號: 202211704161.X
• 申請日: 2022-12-29
• 公開（公告）號: CN115850524A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 王希良;高克學;邵軍超;李世崇;司炳銀;王莉;王立博
• 申請（專利權）人: 北京吉諾衛生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/02;C07K1/18;C07K1/34;C07K1/36;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

本發明公開了一種表達和生產白喉毒素無毒突變蛋白的方法及其使用的特異DNA分子，白喉毒素無毒突變蛋白即CRM197蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發明提供的方法可以在周質中產生CRM197蛋白，與胞內產生CRM197蛋白相比，周質產生CRM197蛋白具有如下優勢：切割信號肽后，蛋白以其成熟形式產生；大腸桿菌的周質是氧化環境，其允許形成二硫鍵，這可幫助產生可溶性、正確折疊的蛋白；周質含有較少的蛋白，可以獲得更純的CRM197蛋白。此外，本發明在周質中產生的CRM197蛋白比現有技術中在周質中產生的CRM197蛋白的表達量高，即獲得了較高得率的CRM197蛋白。本發明具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種表達或生產白喉毒素無毒突變蛋白的方法及其使用的特異DNA分子，白喉毒素無毒突變蛋白即CRM197蛋白。

背景技術

CRM197是一種無毒形式的白喉毒素，但與白喉毒素免疫學上無法區分。CRM197蛋白與白喉毒素具有相同的分子量，但與它的不同在于結構基因中的單堿基改變，因其1個堿基G突變為A，使第52位甘氨酸變成谷氨酰胺，造成酶活位點的改變，無法與NAD結合，導致其喪失細胞毒性。即CRM197蛋白無毒且保留了白喉毒素的免疫原性，是一種較理想的多糖結合疫苗載體蛋白，通過與其他抗原相交聯，提高了疫苗的免疫原性，因此具有廣闊的應用前景。

白喉類毒素和具有無毒突變體形式CRM197是許多抗白喉棒狀桿菌免疫性的疫苗中的組分。白喉毒素和包括CRM197在內的突變體形式也作為對糖安全和有效的T細胞依賴載體用于疫苗中。CRM197目前用于乙型流感嗜血桿菌寡糖CRM197綴合物疫苗中。

用于制備白喉類毒素(DT)的方法在本領域是公知的。例如，DT可通過從白喉棒狀桿菌的培養物中純化毒素后化學解毒而產生，或者可通過純化毒素的重組體或遺傳學上解毒的類似物來制備。由于低蛋白豐度，阻礙了用于疫苗中的白喉毒素的產生。例如Bishai等發現含有白喉毒素(包含tox信號序列)的重組融合蛋白的表達，這導致降解蛋白的產生。克隆含有tox信號序列的白喉片段并將這些序列在大腸桿菌中表達牽涉某些困難。表達的蛋白被分泌到周質間隙中，而該分泌與宿主細胞的降低的生存力和重組蛋白增加的蛋白酶解相關。

很多研究人員通過多種方法改善CRM197蛋白在原核細胞中的表達，但CRM197蛋白的表達量都沒有很好地改善，而且有些還會影響CRM197蛋白活性。大腸桿菌的周質是氧化環境，其允許形成二硫鍵，這可幫助產生可溶性、正確折疊的蛋白。同時大腸桿菌的周質與胞內相比含有更少的蛋白酶，這可幫助避免蛋白酶剪切表達的蛋白；周質還含有較少的蛋白，這允許獲得更純的重組蛋白。因此，迫切需要建立一種用于通過周質表達制備CRM197蛋白的方法。

發明內容

本發明的目的為通過周質表達制備CRM197蛋白(即白喉毒素無毒突變蛋白)。

本發明首先保護一種多肽，其包括信號肽和白喉毒素無毒突變蛋白；所述信號肽包括但不限于信號肽FIGI、信號肽SipA、信號肽YTFQ、信號肽OMPF等。

所述信號肽可為如下A1)-A5)中任一種：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No：4的信號肽FIGI；

A2)氨基酸序列是SEQ ID No：6的信號肽SipA；

A3)氨基酸序列是SEQ ID No：8的信號肽YTFQ；

A4)氨基酸序列是SEQ ID No：10的信號肽OMPF；

A5)將A1)-A4)所述信號肽經過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與A1)-A4)的多肽具有80％以上的同一性且具有相同功能的信號肽。

上述多肽中，所述白喉毒素無毒突變蛋白的氨基酸序列可如SEQ ID NO：1所示。