[發明專利]一種高產乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株的構建方法及應用

在審

• 申請號: 202211701818.7
• 申請日: 2022-12-23
• 公開（公告）號: CN115851570A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 姚建銘
• 申請（專利權）人: 姚建銘
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/56;C12N15/61;C12N15/54;C12P19/26;C12P19/24;C12P19/18;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 許東輝

本發明屬于微生物基因工程技術領域，公開了一種高產乳酰?N?新四糖的大腸桿菌工程菌株的構建方法及應用。本發明的高產乳酰?N?新四糖的大腸桿菌工程菌株過表達重組基因，所述重組基因包括β?1,3?N?乙酰氨基葡萄糖氨基轉移酶基因lgtA、UDP葡萄糖4差向異構酶基因galE、β1,4半乳糖基轉移酶基因，通過質粒組合優化、蛋白標簽共同表達、相關基因敲除以及基因組整合等手段從而提高LNnT產量。本發明選出大腸桿菌工程菌株在搖瓶發酵中LNnT的產量由0.67g/L提高至2.66g/L，5L罐發酵最高LNnT產量達17.26g/L。

技術領域

本發明涉及微生物基因工程技術領域，具體涉及一種高產乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株的構建方法及應用。

背景技術

乳酰-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose，LNnT)是人乳寡糖中重要的成分之一，具有增強人體免疫力，調節腸道菌群和促進細胞成熟等重要的生物學功能，可以作為營養強化劑添加到嬰幼兒配方食品中。目前，LNnT的商業化生產主要包括化學合成和生物合成兩種方法，其中生物合成法僅需以廉價的碳源和細胞內可再生供體為原料，且以較低的環境代價獲得高經濟產出，因此具有更為廣闊的應用前景。

現有技術中，多采用在微生物內LNnT的合成前體包括胞內自身合成的核苷酸UDP-GlcNAc、UDP-Gal以及外源添加的乳糖。其合成過程是，首先胞外乳糖被β-半乳糖苷通透酶LacY轉運至胞內，然后和胞內UDP-GlcNAc在異源表達的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶LgtA催化下生成LNTII。LNTII和UDP-Gal繼續被異源表達的β-1,4-半乳糖基轉移酶LgtB催化生成LNnT。2002年，Bernard Priem等人首次在重組的Escherichia coli JM109中合成了LNnT及巖藻糖化的LNnT。該重組菌株敲除lacZ基因以及過度表達lgtA基因，在甘油為碳源的2-L罐上獲得大約6g/L的LNTII。繼續在此基礎上過度表達lgtB基因，以葡萄糖為碳源，通過高細胞密度培養獲得了超過5g/L的LNnT和乳糖-N-新六糖(LNnH)的混合物。該菌株JM109(pCWlgtA，pBBlgtB)不能在甘油培養基上生長，可能是由于兩個lgtAB基因的過度表達引起的毒性問題，并通過用葡萄糖培養細胞以及在降低培養溫度至28℃來克服。2019年，董曉敏等以Bacillussubtilis168菌株為初始宿主，通過共表達LacY、LgtA和LgtB構建了LNnT的從頭合成途徑。通過各種代謝調節最終菌株在搖瓶和3L生物反應器中LNnT的產量分別達到2.30g/L和5.41g/L。2022年，朱鶯鶯等篩選出一種高效的β 1,4半乳糖基轉移酶，并通過強化前體UDP半乳糖的供應等手段在搖瓶和3L生物反應器中LNnT的產量分別達到0.91g/L和12.14g/L。然而，目前LNnT的微生物合成產量仍然較低，無法滿足大批量工業生產的需求。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處而提供一種高產乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株的構建方法及應用。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案如下：

第一方面，本發明提供了一種高產乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株，所述大腸桿菌工程菌株敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸轉移酶基因wcaj、gdp-甘露糖甘露糖水解酶基因nudD；所述大腸桿菌工程菌株過表達重組基因，所述重組基因包括β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉移酶基因lgtA、UDP葡萄糖4差向異構酶基因galE、β1,4半乳糖基轉移酶基因；所述β 1,4半乳糖基轉移酶基因為lgtB、lgtB-2、hpgalT-1、hpgalT-2、lex-1、lex-2、lex-3、lex-4、lex-5中的任意一種。

本發明篩選了不同來源的β1,4半乳糖基轉移酶合成LNnT，并成功篩選出一種來源于Helicobacter pylori的β1,4半乳糖基轉移酶可以高效的將LNTⅡ和UDP-半乳糖合成LNnT，顯著提升了LNnT的產量。