[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建方法及應(yīng)用在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202211701818.7 | 申請(qǐng)日： | 2022-12-23 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN115851570A | 公開（公告）日： | 2023-03-28 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 姚建銘 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 姚建銘 |
| 主分類號(hào)： | C12N1/21 | 分類號(hào)： | C12N1/21;C12N15/70;C12N15/56;C12N15/61;C12N15/54;C12P19/26;C12P19/24;C12P19/18;C12P19/14;C12R1/19 |
| 代理公司： | 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202 | 代理人： | 許東輝 |
| 地址： | 230088 安徽省合肥市蜀山區(qū)蜀山新*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 高產(chǎn) 新四糖 大腸桿菌 工程 菌株 構(gòu)建 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種高產(chǎn)乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，所述大腸桿菌工程菌株敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因wcaj、gdp-甘露糖甘露糖水解酶基因nudD；所述大腸桿菌工程菌株過表達(dá)重組基因，所述重組基因包括β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶基因lgtA、UDP 葡萄糖4差向異構(gòu)酶基因galE、β 1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因；所述β 1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因?yàn)閘gtB、lgtB-2、hpgalT-1、hpgalT-2、lex-1、lex-2、lex-3、lex-4、lex-5中的任意一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，所述重組基因的表達(dá)載體采用pBluescript II SK(+)、pCDFDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，所述β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶基因lgtA和UDP葡萄糖4差向異構(gòu)酶基因galE的表達(dá)載體為pRSFDuet-1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，所述β1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因hpgalT-1的表達(dá)載體為pETDuet-1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，所述β1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因hpgalT-1的N端插入有融合標(biāo)簽；所述融合標(biāo)簽為MBP、SUMO、TrxA、Fh8、hisProp中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，所述大腸桿菌工程菌株還敲除葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsA、UDP葡萄糖6-脫氫酶基因ugd、生物膜PGA合成酶基因pgaCD、葡糖胺-6-磷酸脫氨酶基因nagB、UDP-N-乙酰氨基葡糖十一烷基磷酸N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因wecA、UDP-N-乙酰葡糖胺2-二聚體酶基因wecB、甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因manA、NADP+依賴性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因zwf。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株，其特征在于，所述大腸桿菌工程菌株的基因組在galM位點(diǎn)整合有g(shù)alETKM基因簇，在敲除的lacZ位點(diǎn)整合有l(wèi)acZΔm15基因。
8.一種權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的高產(chǎn)乳酰-N-新四糖的大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)構(gòu)建所述重組基因的重組表達(dá)載體；
(2)采用CRISPER方法敲除所述β-半乳糖苷酶基因lacZ、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因wcaj、gdp-甘露糖甘露糖水解酶基因nudD，得基因敲除大腸桿菌；
(3)將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述基因敲除大腸桿菌，得所述大腸桿菌工程菌株。
9.權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的大腸桿菌工程菌株在生產(chǎn)乳酰-N-新四糖中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生產(chǎn)包括發(fā)酵罐或搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。
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