[發明專利]一種非組培枳高效毛狀根轉化方法

在審

• 申請號: 202211686956.2
• 申請日: 2022-12-26
• 公開（公告）號: CN115873895A
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 潘志勇;彭佳璇;樊正炎;周星星
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H6/78
• 代理公司: 武漢泰山北斗專利代理事務所(特殊普通合伙) 42250
• 代理人: 程千慧

本發明涉及一種非組培枳高效毛狀根轉化方法，包括以下步驟：1.利用枳果實種子進行培養獲得用于侵染的枳實生苗；2.制備供侵染所用的發根農桿菌菌液；3.將步驟1所獲得的枳實生苗置于步驟2的發根農桿菌菌液中，隨后在30?40psi下真空滲透25min以上后轉入含有蛭石基質的透氣且保濕的培養容器中，在黑暗條件下培養3?4天，隨后轉入16小時光照/8小時黑暗條件下交替培養，誘導發根，獲得轉基因毛狀根。本發明共培養15d左右就可以看到白色愈傷，25d左右就能得到轉基因陽性毛狀根，并且轉基因毛狀根誘導效率可以達到90％以上，耗時較短。

技術領域

本發明涉及植物毛狀根轉化方法技術領域，具體涉及一種非組培枳高效毛狀根轉化方法。

背景技術

毛狀根是植物組織在受傷部位受到發根農桿菌的侵染時所形成的一種病理性生長，在傷口處會形成有多個分支的不定根，呈毛發狀，故被稱為毛狀根。受到侵染后，發根農桿菌Ri質粒上的T-DNA片段會插入到植物基因組中，并且T-DNA片段中含有植物生長素合成基因，可以誘導植物生成帶有目的基因轉基因根系。毛狀根具有生長速度快、不需要外源激素、遺傳穩定等優點，具有很大的應用前景。

柑橘類水果是世界上產量最大的水果。柑橘作為無性繁殖的樹種，枳是應用最為廣泛的砧木，其具有耐寒等優良特性，但枳不耐鹽堿也不抗旱，所以需要結合分子技術手段對枳進行抗性育種改良。農桿菌介導的遺傳轉化已經廣泛的應用在柑橘上，一是使用根癌農桿菌侵染節間莖段，獲得轉基因陽性再生芽后使其生根獲得轉基因株系；二是使用發根農桿菌侵染上胚軸切口處獲得轉基因毛狀根，這兩種方法在操作時都需要保持嚴格的無菌環境，并且每20d左右就需要繼代，繼代2-3次才可以獲得轉基因株系，不僅操作麻煩，而且耗時較長，轉化效率只能達到50％左右。目前已經有多種植物具有非組培毛狀根誘導培養體系，但每種植物的誘導培養體系都不同，并且同一種培養體系換一種物種就很難成功，還未有一種明確的非組培方法能夠在枳上成功獲得轉基因毛狀根。本發明提供了一種非組培枳高效毛狀根轉化方法，將目的基因轉入發根農桿菌并侵染枳，轉基因毛狀根誘導效率可以達到90％以上。

發明內容

根據現有技術存在的問題，本發明公開了一種非組培枳高效毛狀根轉化方法

一種非組培枳高效毛狀根轉化方法，包括以下步驟：

步驟1.利用枳果實種子進行培養獲得用于侵染的枳實生苗；

步驟2.制備供侵染所用的發根農桿菌菌液；

步驟3.將步驟1所獲得的枳實生苗置于步驟2的發根農桿菌菌液中，隨后在30-40psi下真空滲透25min以上后轉入含有蛭石基質的透氣且保濕的培養容器中，在黑暗條件下培養3-4天，隨后轉入16小時光照/8小時黑暗條件下交替培養，誘導發根，獲得轉基因毛狀根。

進一步的，所述步驟1具體包括以下步驟：

步驟1.1、取新鮮的枳果實種子，清洗干凈后，利用1mol/L氫氧化鈉處理15min去除果膠；

步驟1.2、將種子置于30％的次氯酸鈉溶液中消毒10min后置于濕潤的紗布上，25-30℃條件下暗培養幾天；

步驟1.3、待種子發芽后即可轉移到基質中，置于26±2℃的生長室16小時光照/8小時黑暗條件下至枝條出現木質化后即得到用于侵染的枳實生苗。

進一步的，所述步驟2具體包括以下步驟：

步驟2.1、將外源基因或是插入有外源基因的質粒轉入發根農桿菌，并將發根農桿菌的菌液以1：200的比例接種到含抗生素的40-50mL LB液體培養基中，在28℃和200r/min搖床條件下培養12h以上，得到備用菌液；

步驟2.2、將備用菌液在室溫，4000r/min條件下離心5min，棄上清用40mL MT懸浮培養基重懸，加入50mg/L乙酰丁香酮，調整農桿菌菌液OD600在0.6-1.0即得到供侵染所用的發根農桿菌菌液。