[發(fā)明專利]一種非組培枳高效毛狀根轉(zhuǎn)化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211686956.2
• 申請(qǐng)日: 2022-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN115873895A
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘志勇;彭佳璇;樊正炎;周星星
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H5/06;A01H6/78
• 代理公司: 武漢泰山北斗專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42250
• 代理人: 程千慧

1.一種非組培枳高效毛狀根轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1.利用枳果實(shí)種子進(jìn)行培養(yǎng)獲得用于侵染的枳實(shí)生苗；

步驟2.制備供侵染所用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液；

步驟3.將步驟1所獲得的枳實(shí)生苗置于步驟2的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，隨后在30-40psi下真空滲透25min以上后轉(zhuǎn)入含有蛭石基質(zhì)的透氣且保濕的培養(yǎng)容器中，在黑暗條件下培養(yǎng)3-4天，隨后轉(zhuǎn)入16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗條件下交替培養(yǎng)，誘導(dǎo)發(fā)根，獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非組培枳高效毛狀根轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟1具體包括以下步驟：

步驟1.1、取新鮮的枳果實(shí)種子，清洗干凈后，利用1mol/L氫氧化鈉處理15min去除果膠；

步驟1.2、將種子置于30％的次氯酸鈉溶液中消毒10min后置于濕潤(rùn)的紗布上，25-30℃條件下暗培養(yǎng)幾天；

步驟1.3、待種子發(fā)芽后即可轉(zhuǎn)移到基質(zhì)中，置于26±2℃的生長(zhǎng)室16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗條件下至枝條出現(xiàn)木質(zhì)化后即得到用于侵染的枳實(shí)生苗。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非組培枳高效毛狀根轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟2具體包括以下步驟：

步驟2.1、將外源基因或是插入有外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，并將發(fā)根農(nóng)桿菌的菌液以1：200的比例接種到含抗生素的40-50mL LB液體培養(yǎng)基中，在28℃和200r/min搖床條件下培養(yǎng)12h以上，得到備用菌液；

步驟2.2、將備用菌液在室溫，4000r/min條件下離心5min，棄上清用40mL MT懸浮培養(yǎng)基重懸，加入50mg/L乙酰丁香酮，調(diào)整農(nóng)桿菌菌液OD600在0.6-1.0即得到供侵染所用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非組培枳高效毛狀根轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟3中的培養(yǎng)容器為帶有可調(diào)節(jié)透氣孔的組培瓶。