[發(fā)明專利]一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)拷貝數(shù)變異的文庫(kù)構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211679381.1
• 申請(qǐng)日: 2022-12-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115976654A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉增瑋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州璞瑞卓越生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C40B50/06
• 分類號(hào): C40B50/06;C40B40/08;C12Q1/6806;C12Q1/6869;G16B20/10;G16B20/20;G16B30/00;G16B50/00
• 代理公司: 南京鼎坤專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32681
• 代理人: 王芳芳

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)拷貝數(shù)變異的文庫(kù)構(gòu)建方法，涉及文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域。該基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)拷貝數(shù)變異的文庫(kù)構(gòu)建方法包括以下步驟：待測(cè)樣本的處理和模板的提取、使用內(nèi)切酶對(duì)模板進(jìn)行酶切、酶切完成后按接頭Mix配制數(shù)據(jù)配制接頭Mix、片段雙選、文庫(kù)擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化、DNA文庫(kù)質(zhì)檢以及文庫(kù)測(cè)序。該基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)拷貝數(shù)變異的文庫(kù)構(gòu)建方法，可高效特異捕獲全基因組SNP用于CNV分析，提高CNV檢測(cè)類型和準(zhǔn)確性；CNV檢測(cè)方法與CNV?Seq相比，可以檢測(cè)CNV?seq能夠檢測(cè)的非整倍體、重復(fù)、缺失，也能檢測(cè)CNV?seq技術(shù)無(wú)法檢測(cè)的單倍體、三倍體、多倍體和LOH等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)拷貝數(shù)變異的文庫(kù)構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

拷貝數(shù)變異(CNV)檢測(cè)類型包括：非整倍體、重復(fù)、缺失、嵌合、雜合性丟失(lossof?heterozygosity，LOH)、單親二體(uniparentaldisomy，UPD)、單倍體、三倍體和多倍體等。染色體非整倍體是指體外受精-胚胎移植周期中發(fā)生胚胎染色體非整倍體(aneuploidy)異常，表現(xiàn)為在正常二倍體基礎(chǔ)上，染色體數(shù)目增加或減少一條甚至多條；重復(fù)是指染色體上增加了相同的某個(gè)區(qū)段因而引起變異的現(xiàn)象；缺失是指染色體某一區(qū)段丟失的現(xiàn)象；嵌合體在遺傳學(xué)上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現(xiàn)的個(gè)體；雜合性丟失(LOH)是指一對(duì)同源染色體上特定位點(diǎn)的等位基因，一側(cè)帶有突變(有害)，一側(cè)正常，由于某種原因，正常的一側(cè)對(duì)應(yīng)序列發(fā)生缺失或突變，致使該基因座位變?yōu)榘牒匣蚣兒希粏斡H二體(UPD)指來(lái)自父母一方的染色體片段被另一方的同源部分取代，或一個(gè)個(gè)體的兩條同源染色體都來(lái)自同一親體；單倍體是指體細(xì)胞含有一套染色體組，三倍體則是指每一個(gè)細(xì)胞中具有三套完整的染色體組。基因組拷貝數(shù)變異的檢測(cè)可應(yīng)用到組織檢測(cè)如腫瘤組織、羊水、流產(chǎn)物組織，液體活檢如血液、尿液的細(xì)胞、游離核酸，單細(xì)胞領(lǐng)域如胚胎植入前遺傳學(xué)診斷、胚胎植入遺傳學(xué)篩查、癌癥患者血液中游離的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、孕婦外周血中游離的胎兒細(xì)胞、干細(xì)胞、單細(xì)胞或幾個(gè)細(xì)胞的微生物。

目前基因組拷貝數(shù)變異檢測(cè)的主要方法有：比較基因組雜交，熒光定量PCR，熒光原位雜交，多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)，高通量測(cè)序。其中，比較基因組雜交分辨率比較低，Mb級(jí)，通量低，成本高；熒光定量PCR同樣通量低，成本高，一次只能測(cè)一個(gè)拷貝數(shù)變異；熒光原位雜交，只針對(duì)特定位置，分辨率低，探針雜交效率不穩(wěn)定；多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)，操作復(fù)雜，通量低，成本高，覆蓋度小，易造成PCR污染；鑒于此，我們提出了一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)拷貝數(shù)變異的文庫(kù)構(gòu)建方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)拷貝數(shù)變異的文庫(kù)構(gòu)建方法，解決了上述背景技術(shù)提到的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)拷貝數(shù)變異的文庫(kù)構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

S1、待測(cè)樣本的處理和模板的提取；

S2、使用內(nèi)切酶對(duì)模板進(jìn)行酶切；

S3、酶切完成后按接頭Mix配制數(shù)據(jù)配制接頭Mix；

S4、片段雙選；

S5、文庫(kù)擴(kuò)增；

S6、PCR產(chǎn)物純化；

S7、DNA文庫(kù)質(zhì)檢；

S8、文庫(kù)測(cè)序。

可選的，所述S1進(jìn)一步的包括以下步驟：

樣品適用范圍包括手術(shù)切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病理組織，石蠟切片及血液等標(biāo)本；

蠟塊樣品切成5～8μM切片，取5片，或已經(jīng)制成的5～8μM切片取5片，經(jīng)過(guò)脫蠟劑脫蠟后，使用石蠟包埋DNA提取試劑盒提取基因組DNA；