[發明專利]一種基于高通量測序技術檢測拷貝數變異的文庫構建方法

在審

• 申請號: 202211679381.1
• 申請日: 2022-12-26
• 公開（公告）號: CN115976654A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 劉增瑋
• 申請（專利權）人: 蘇州璞瑞卓越生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/08;C12Q1/6806;C12Q1/6869;G16B20/10;G16B20/20;G16B30/00;G16B50/00
• 代理公司: 南京鼎坤專利代理事務所(普通合伙) 32681
• 代理人: 王芳芳

1.一種基于高通量測序技術檢測拷貝數變異的文庫構建方法，其特征在于：所述構建方法包括以下步驟：

S1、待測樣本的處理和模板的提取；

S2、使用內切酶對模板進行酶切；

S3、酶切完成后按接頭Mix配制數據配制接頭Mix；

S4、片段雙選；

S5、文庫擴增；

S6、PCR產物純化；

S7、DNA文庫質檢；

S8、文庫測序。

2.根據權利要求1所述的一種基于高通量測序技術檢測拷貝數變異的文庫構建方法，其特征在于：所述S1進一步的包括以下步驟：

樣品適用范圍包括手術切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病理組織，石蠟切片及血液等標本；

蠟塊樣品切成5～8μM切片，取5片，或已經制成的5～8μM切片取5片，經過脫蠟劑脫蠟后，使用石蠟包埋DNA提取試劑盒提取基因組DNA；

新鮮病理組織使用組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA；

血液樣本使用提取試劑盒提取基因組DNA；

所提DNA溶于1×TE，使用Qubit?4.0對提取好的DNA進行定量，確認模板濃度后使用1×TE溶液調整DNA濃度到10ng/μL作為PCR擴增的模板。

3.根據權利要求1所述的一種基于高通量測序技術檢測拷貝數變異的文庫構建方法，其特征在于：所述S4進一步的包括以下步驟：

將連接產物轉移至1.5mL離心管中，加入70μL無核酸酶水補足至100μL，加入60μL?DNA純化磁珠，混勻后室溫放置5分鐘；

放置到磁力架上，然后磁力架上放置4分鐘至液體澄清，轉移上清至新的1.5mL離心管中；

加入18μL?DNA純化磁珠，混勻后室溫放置5分鐘，放置到磁力架上，等液體清亮，去上清，用200μL的80％酒精清洗；

室溫干燥后用22μL?Low?TE提取DNA，取20μL溶液于新的0.2mL?PCR管中。

4.根據權利要求1所述的一種基于高通量測序技術檢測拷貝數變異的文庫構建方法，其特征在于：所述S5進一步的包括以下步驟：

S51、按照配制表配制反應體系；

S52、按擴增程序數據擴增程序進行PCR擴增。

5.根據權利要求1所述的一種基于高通量測序技術檢測拷貝數變異的文庫構建方法，其特征在于：所述S6進一步的包括以下步驟：

S61、向PCR產物管中加入50uL磁珠，用移液器吹打混勻，室溫孵育2min；

S62、將孵育完成的產物管放置到磁力架上進行磁珠吸附，待溶液澄清后，小心吸取上清，棄上清保留磁珠；

S63、向上步PCR管中加入200uL80％的乙醇，用磁力架快速在PCR管不同的面吸附2-3次，充分洗滌磁珠，靜置15s后，用移液器小心吸取上清，棄上清保留磁珠；

S64、重復步驟S63一次；

S65、將含有磁珠的PCR管置于磁力架上室溫靜置，待到管中乙醇完全揮發后，向PCR管中加入20uL無核酸酶水，充分混勻洗滌磁珠后靜置2min；

S66、將孵育完成的產物管放置到磁力架上進行磁珠吸附，待溶液澄清后，小心吸取上清轉移至新的PCR管中，即為洗脫得到的DNA文庫，棄去磁珠。

6.根據權利要求1所述的一種基于高通量測序技術檢測拷貝數變異的文庫構建方法，其特征在于：所述S7進一步的包括：使用Qubit?4.0對文庫濃度進行測定，使用labchip對文庫的片段大小進行測定。

7.根據權利要求1所述的一種基于高通量測序技術檢測拷貝數變異的文庫構建方法，其特征在于：所述S8進一步的包括：

測序使用Miseq測序儀進行測序，使用V2芯片，測序讀長PE150；

測序完成后得到目標序列信息，即fastq文件；

然后將上述獲得的fastq文件經生信分析處理，通過與野生型序列信息進行比對得到基因突變信息。