[發(fā)明專利]小鼠/人胚胎干細(xì)胞來源的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液及小鼠/人的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211671175.6
• 申請(qǐng)日: 2022-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN115927167A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳寶江;包斯琴;王艷秋;李喜和
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/0735
• 分類號(hào): C12N5/0735;C12N5/073
• 代理公司: 天津佳盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 李淑惠

一種小鼠和人胚胎干細(xì)胞來源的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液及小鼠和人的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，利用化學(xué)成分明確的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液，使小鼠/人的ESCs分化成自然囊胚所包含的三種不同細(xì)胞譜系，繼續(xù)利用該類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液，將上一步獲得的小鼠/人的含有三種不同細(xì)胞譜系的混合狀態(tài)細(xì)胞，在懸浮培養(yǎng)的條件下誘導(dǎo)獲得小鼠和人的類囊胚結(jié)構(gòu)。本發(fā)明利用特定的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液及誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，使小鼠/人的ESCs自我組裝產(chǎn)生類囊胚結(jié)構(gòu)，通過實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證了小鼠和人的類囊胚在形態(tài)、大小、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞分布以及基因表達(dá)特征方面與自然囊胚相似，為體外組織形態(tài)發(fā)生、類器官建模和藥物篩選等提供新的研究模型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種小鼠和人的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液，尤其建立一種小鼠和人胚胎干細(xì)胞來源的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

胚胎干細(xì)胞(ESCs)起源于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，可以貢獻(xiàn)到胎兒所有組織中，但不參與胎盤發(fā)育。在合適的體外培養(yǎng)條件下，小鼠和人的ESCs能分化形成一種三維聚集體，稱為胚狀體(EBs)，它包含機(jī)體三種不同譜系細(xì)胞類型，可用來模擬早期胚胎發(fā)生研究。EBs的形成是ESCs自我組裝和譜系分化的重要特征，然而EBs不能完全重塑胚胎發(fā)育的起始。

在過去的幾年里，基于胚胎干細(xì)胞的類胚胎研究取得了突破性進(jìn)展，一些研究報(bào)道了利用小鼠或人類胚胎干細(xì)胞體外重構(gòu)獲得囊胚或原腸期胚胎的發(fā)育模型。但是到目前為止，小鼠類囊胚的體外誘導(dǎo)仍需兩種或三種不同類型的干細(xì)胞共同培養(yǎng)才能實(shí)現(xiàn)，而且培養(yǎng)條件非常復(fù)雜。能否只利用小鼠或人的胚胎干細(xì)胞，在化學(xué)成分明確的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下獲得類囊胚結(jié)構(gòu)，未見相關(guān)報(bào)道。

因此，獲得一種簡(jiǎn)單高效的小鼠和人的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液，尤其僅由小鼠和人胚胎干細(xì)胞來源的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，是解決類囊胚體外誘導(dǎo)方法局限性的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種小鼠和人胚胎干細(xì)胞來源的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液，并建立類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，首次利用單一種類的胚胎干細(xì)胞系誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得大量的小鼠和人的類囊胚結(jié)構(gòu)。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種小鼠/人胚胎干細(xì)胞來源的類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液，其特征在于：包括以下組分：每500ml類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液含CHIR99021的組成為：

余量由基礎(chǔ)培養(yǎng)液補(bǔ)充，

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM/F12和基礎(chǔ)培養(yǎng)液Neurobasal，二者體積比為1:1。

優(yōu)選，每500ml類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液含CHIR99021的組成為：

3一種小鼠/人胚胎干細(xì)胞來源的類胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)準(zhǔn)備含PD0325901+CHIR99021+LIF的2i/L培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞和mTeSR^TM1培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞，分別在37℃、5％?CO₂濃度條件下培養(yǎng)。

(2)取步驟(1)準(zhǔn)備的1×10⁵個(gè)小鼠/人ESCs分別利用類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液，在37℃、5％?CO₂濃度條件下進(jìn)行培養(yǎng)5-7天，分別獲得小鼠/人的含有囊胚三種類型細(xì)胞的混合細(xì)胞。

(3)取步驟(2)得到的混合細(xì)胞1×10⁵個(gè)，在37℃、5％?CO₂濃度條件下利用類囊胚誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液，小鼠混合細(xì)胞在體外培養(yǎng)到3-4天，或人的混合細(xì)胞在體外培養(yǎng)到6-7天時(shí)開始形成小鼠和人的類囊胚結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的有益效果是：