[發明專利]一種針對ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統及其應用

在審

• 申請號: 202211671132.8
• 申請日: 2022-12-26
• 公開（公告）號: CN116004720A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 李善剛;鄧莉;陳麗嬌;孫文杰
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/64;A61K48/00;A61K38/46;A61P3/00
• 代理公司: 昆明科眾知識產權代理事務所(普通合伙) 53218
• 代理人: 蔣晗

本發明公開了一種針對ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統及其應用。將NGABEmax載體中的spCas9?NG蛋白在573?574位之間拆分得到兩部分；隨后將sgP992L構進NGABEmax?DOWN中，得到sgP992L?NGABEmax?DOWN載體。拆分后的NGABEmax更便于運輸至靶細胞內，可通過內含肽方式在靶細胞內重新組合，發揮完整的堿基編輯作用。本發明通過對ATP7B基因P992L突變位點設計gRNA，搭配拆分的NGABEmax系統實現目標基因位點堿基A→G的高效雙載體修復，是針對ATP7B基因P992L突變的威爾遜病患者基因治療研究的一種新型載體和有力手段。

技術領域

本發明涉及堿基編輯基因治療技術領域，具體涉及一種針對ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統及其應用。

背景技術

威爾遜病(Wilson?Disease,WD)又稱為肝豆狀核變性，該病是由ATP7B基因突變引起的銅代謝障礙疾病。ATP7B基因定位于染色體13q14.3，全長80kb，包含21個外顯子，其中第13外顯子中的P992L突變為G·C→A·T的單堿基突變，該類型患者占中國威爾遜病患者的15.5％，屬于高發突變類型，但是目前尚無徹底有效的治療手段。近年來，堿基編輯(Baseediting,BE)技術發展迅速且日漸成熟，ABE堿基編輯器適合用于G·C→A·T突變類型的基因修復研究，使得針對WD患者點突變的基因修復治療成為可能。

目前WD基因治療臨床應用最廣泛的遞送載體為AAV病毒，AAV具有免疫原性較低，基本不組合到宿主的基因組等優點，但其包裝容量有所限制僅為4.7kb。堿基編輯系統加上sgRNA序列一般都會超過4.7kb，為了解決這個問題，將堿基編輯系統進行拆分，使其分別包裝進AAV病毒中進行蛋白表達和特定sgRNA表達，然后兩個蛋白和sgRNA組合成完整的體系行使其堿基編輯功能，修復堿基突變。

發明內容

本發明提供了一種高效治療ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統。本發明為解決目前在利用堿基編輯載體系統基因治療ATP7B基因P992L突變WD疾病時，堿基編輯系統過大，無法完全包裝進臨床應用最廣泛的AAV病毒中的問題。AAV病毒的包裝容量一般小于4.7kb，而目前應用的堿基編輯系統加上sgRNA普遍超過4.7kb，所以，本發明通過對NGABEmax這個堿基編輯系統進行拆分，使其分為兩部分，分別包裝進AAV病毒中遞送至靶細胞內，在靶細胞內通過內含肽方式將其重新組合，發揮其作用，以此解決包裝容量的問題。NGABEmax拆分之后NGABEmax-UP?ITR中間序列長度為4.3kb，如圖1中a所示。rsgP992L-NGABEmax-DOWN?ITR中間序列長度為4.0kb，如圖1中b所示，都未超過AAV病毒的包裝限制4.7kb。故本拆分系統可以使用AAV病毒進行包裝用于治療ATP7B基因P992L突變WD疾病，為臨床基因治療ATP7B基因P992L突變提供參考。

為了解決上述技術問題，本發明采取的技術方案如下：一種用于治療ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統，所述堿基編輯系統為NGABEmax，將NGABEmax系統拆分成兩段氨基酸序列，拆分后的NGABEmax系統更便于運輸至靶細胞內，可通過內含肽方式在靶細胞內重新組合發揮完整的堿基編輯作用，配合sgP992L實現ATP7B基因P992L突變的編輯。

一種針對ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統，所述堿基編輯系統的載體為NGABEmax，將NGABEmax載體中的spCas9-NG蛋白在573-574位氨基酸之間拆分得到NGABEmax-UP和NGABEmax-DOWN兩部分；隨后將sgP992L構進NGABEmax-DOWN中，得到sgP992L-NGABEmax-DOWN載體。