[發明專利]一種針對ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統及其應用

在審

• 申請號: 202211671132.8
• 申請日: 2022-12-26
• 公開（公告）號: CN116004720A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 李善剛;鄧莉;陳麗嬌;孫文杰
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/64;A61K48/00;A61K38/46;A61P3/00
• 代理公司: 昆明科眾知識產權代理事務所(普通合伙) 53218
• 代理人: 蔣晗

1.一種針對ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統，其特征在于，所述堿基編輯系統的載體為NGABEmax，將NGABEmax載體中的spCas9-NG蛋白在573-574位氨基酸之間拆分得到NGABEmax-UP和NGABEmax-DOWN兩部分；隨后將sgP992L構進NGABEmax-DOWN中，得到sgP992L-NGABEmax-DOWN載體。

2.根據權利要求1所述的針對ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統，其特征在于，所述NGABEmax-UP載體構建分為3部分：Cbh啟動子由px458載體PCR擴增而得；核定位序列SV40NLS、腺嘌呤脫氨酶ABEmax和1-573位spCas9-NG-N由NGABEmax載體PCR擴增而得；內含肽inteinN和polyA序列BGHpA由pLV302載體PCR擴增而得，然后將3個片段的PCR擴增產物使用無縫克隆試劑盒，進行同源重組放進AAV的骨架得到NGABEmax-UP載體，ITR中間序列如SEQ?ID?No.1所示。

3.根據權利要求1所述的針對ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統，其特征在于，所述sgP992L-NGABEmax-DOWN載體構建分為4部分：Cbh啟動子由px458載體PCR擴增而得；內含肽inteinC由pLV312.3載體PCR擴增而得；574-1368位spCas9-NG-C、核定位序列SV40NLS和polyA序列BGHpA由NGABEmax載體PCR擴增而得，將這3個片段的PCR擴增產物使用無縫克隆試劑盒，按照說明書進行同源重組放進AAV的骨架中，得到同源重組中間載體，第4部分hU6-sgP992L部分由pGL3-U6-sgP992L-PGK-puromycin9載體PCR擴增而得，經MluⅠ和XbaⅠ酶切PCR片段和同源重組載體后，T4DNA連接酶兩片段，轉化，挑單克隆菌株，擴大培養提質粒，而后得到sgP992L-NGABEmax-DOWN載體，ITR中間序列如SEQ?ID?No.2所示。

4.根據權利要求1所述的針對ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統，其特征在于，所述堿基編輯拆分載體系統采用ABE堿基編輯的方式，通過gRNA靶向ATP7B基因P992L突變目標位點，利用整合ABE功能原件進行堿基A→G的突變，實現ATP7B基因P992L突變的編輯。

5.根據權利要求4所述的針對ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統，其特征在于，所述P992L突變對應的gRNA長度為20堿基，PAM序列為NG，所述目標堿基A位于gRNA5’-3’的第6位。

6.根據權利要求4所述的針對ATP7B基因P992L突變的堿基編輯拆分載體系統，所述gRNA對應的寡核苷酸單鏈DNA，即Oligo-F和Oligo-R序列，分別如SEQ?ID?No.3和SEQIDNo.4所示。

7.根據權利要求1-4任意一項所述的堿基編輯拆分載體系統的用途，其特征在于，所述堿基編輯拆分載體系統制備用于治療ATP7B基因P992L突變的威爾遜病藥物。