[發明專利]一組穿心蓮內酯合成相關P450細胞色素酶及其應用

在審

• 申請號: 202211669385.1
• 申請日: 2022-12-24
• 公開（公告）號: CN115851637A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 周景文;李珊;高松;徐沙;曾偉主;余世琴
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/81;C12N1/19;C12P7/42;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一組穿心蓮內酯合成相關P450細胞色素酶及其應用，屬于生物工程領域。本發明在穿心蓮來源原始序列CYP71A8和CYP71D10的基礎上，截短信號肽序列，成功實現了截短信號肽后CYP7A8和CYP71D10的異源表達。本發明以釀酒酵母CEN.PK2?1D為宿主，敲除基因組上的ROX1、GAL80基因，并在ROX1位點整合表達GGPP合酶和CPS二萜合酶的編碼基因；游離表達CYP71A8和CYP71D10和ApCPR，成功構建重組釀酒酵母，實現了3,15,19?Trihydroxy?8(17),13?ent?labdadiene?16?oicacid的從頭合成，相比空白實現產物峰的響應值達1.9*106，是目前生物合成3,15,19?Trihydroxy?8(17),13?ent?labdadiene?16?oicacid的唯一相關報道，此策略為解析穿心蓮內酯生物合成途徑，和利用代謝工程合成穿心蓮內酯及其相關衍生提供了必要的參考。

技術領域

本發明涉及一組穿心蓮內酯合成相關P450細胞色素酶及其應用，屬于應用微生物及酶工程領域。

背景技術

細胞色素氧化酶(cytochrome P450，P450)屬于血紅素氧化酶超家族，因還原態的血紅素氧化酶與CO結合形成復合物在450nm附近有最大吸收峰而被命名為細胞色素P450酶。根據P450酶的細胞定位以及氧化還原伴侶蛋白(NADPH-cytochrome P450 reductase，CPR)的組成，可以分為5類Class，其中Class I需要額外的電子傳遞蛋白將電子NAD(P)H傳遞到P450酶活性中心進而完成整個催化過程。

ent-Copalol和3,15,19-Trihydroxy-8(17),13-ent-labdadiene-16-oic acid是含有四個異戊二烯的二萜化合物，存在于草本植物穿心蓮中，是穿心蓮體內合成穿心蓮內酯的兩個重要的中間化合物，穿心蓮內酯具有清熱解毒、消腫止痛作用，被譽為“天然抗生素藥物，然而目前關于合成穿心蓮內酯的P450酶、途徑物質3,15,19-Trihydroxy-8(17),13-ent-labdadiene-16-oic acid的催化反應相關信息未曾有過報道。因此，研究合成過程中CYP450酶的活性和功能對了解穿心蓮內酯合成全途徑具有重要意義。

CYP450酶為膜蛋白，其形成需要一系列的翻譯后修飾。真核表達宿主具有較完善的內質網、高爾基體等內膜結構的翻譯后修飾系統，使表達出的異源蛋白更接近于其天然構象，真核微生物通常被認為是異源表達CYP450酶的合適系統。另外，真核微生物內源的CPR可介導電子有效的向CYP450酶傳遞，有助于CYP450酶發揮其催化功能，催化合成3,15,19-Trihydroxy-8(17),13-ent-labdadiene-16-oic acid應用了真核微生物的天然優勢(圖1)。根據現有的研究，暫無實現從頭合成3,15,19-Trihydroxy-8(17),13-ent-labdadiene-16-oic acid的真核微生物重組菌

發明內容

本發明中穿心蓮來源的CYP71A8和CYP71D10屬于Class I的CYP71家族，需要電子傳遞蛋白催化活性，但具體生物功能未被報道過，因此本發明為首次對CYP71A8和CYP71D10進行異源表達并公布其催化功能。

本發明的第一個目的是提供穿心蓮來源的CYP450酶在催化合成3,15,19-Trihydroxy-8(17),13-ent-labdadiene-16-oic acid中的應用。

在一種實施方式中，所述穿心蓮來源的CYP450酶為CYP71A8和CYP71D10。

在一種實施方式中，所述CYP71A8的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CYP71D10的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一種實施方式中，所述CYP71A8的N端截短32位氨基酸，所述CYP71D10的N端截短28位氨基酸。