[發(fā)明專利]一種用于擴(kuò)增cDNA 5’末端的通用接頭引物及5’RACE方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211650038.4
• 申請日: 2022-12-21
• 公開（公告）號: CN115976173A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王冬;熊園
• 申請（專利權(quán)）人: 生工生物工程（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 陳秋夢

本發(fā)明公開了一種用于擴(kuò)增cDNA?5’末端的通用接頭引物及5’RACE方法，涉及cDNA末端擴(kuò)增的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的接頭引物序列，經(jīng)擴(kuò)增cDNA?5’末端后，非特異性擴(kuò)增條帶明顯減少，目的產(chǎn)物更多。本發(fā)明提供的試劑盒以及5’RACE方法操作簡便，尤其是可通過提前預(yù)混PCR反應(yīng)體系明顯減少了實(shí)驗(yàn)操作步驟，大幅縮短了cDNA擴(kuò)增周期。本發(fā)明提供的5’RACE方法對未知片段的克隆效率高。通過兩輪PCR、幾個簡單的步驟操作，即可完成5’端未知序列的擴(kuò)增，獲得完整的編碼區(qū)5’端序列信息。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及cDNA末端擴(kuò)增的技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于擴(kuò)增cDNA?5’末端的通用接頭引物及5’RACE方法。

背景技術(shù)

RACE(rapid-amplification?of?cDNA?ends)稱為cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，是一種快速克隆目的mRNA的3’或5’末端以獲得mRNA全長的分子生物學(xué)技術(shù)。RACE技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢被應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如cDNA文庫的建立、目的基因克隆、病毒基因組功能的研究、新的表達(dá)序列標(biāo)簽研發(fā)(expressed?sequence?tag,ESTs)等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家結(jié)合其他不同的分子生物學(xué)技術(shù)對最初的RACE技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，從而豐富了RACE技術(shù)的類型。目前使用的RACE技術(shù)包括：經(jīng)典RACE、Adapter?Ligated?RACE、RLM?RACE、Capswitching?RACE、環(huán)形RACE和T-RACE等。

5’RACE基本原理：5’RACE是對基因未知5’末端進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。本發(fā)明先利用mRNA中的一段特異序列作為結(jié)合位點(diǎn)，以特異性的反轉(zhuǎn)錄引物在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，合成第一鏈cDNA。在TdT酶作用下加上(dC)殘基，退火后，(dC)殘基與含有寡核苷酸序列的通用接頭引物5’adaptor?Primer配對，以特異引物R1作為下游引物，以第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物5’RACE?Outer?Primer作為上游引物，以另一個特異引物R2作為下游引物，把目的基因5’末端的cDNA片段擴(kuò)增出來。

目前常用的5’RACE實(shí)驗(yàn)方法有三種：接頭連接法(adaptor?ligation)、去帽法(oligo?caping?method)和末端轉(zhuǎn)移酶法(terminaldeoxynucleotidyl?transferasemethod，TdT?method)。

接頭連接法以SMARTer?RACE?cDNA?Amplification?Kit(Clontech?Code:634923)為代表。該方法原理是先利用mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作為逆轉(zhuǎn)錄引物的結(jié)合位點(diǎn)，以O(shè)ligo(dT)作為逆轉(zhuǎn)錄引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，合成第一鏈cDNA，該逆轉(zhuǎn)錄酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，在逆轉(zhuǎn)錄達(dá)到5’末端時自動加上3-5個(dC)殘基，退火后(dC)殘基與含有寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接頭引物5’adaptor?Primer配對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，把目的基因5’末端的cDNA片段擴(kuò)增出來。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，一次逆轉(zhuǎn)錄可以獲得全部基因模板用于多個基因的5’RACE實(shí)驗(yàn)，RNA質(zhì)量較高的前提下，獲得全長分子比例高。cDNA第一鏈合成和加尾一步完成，最大限度降低了mRNA的降解風(fēng)險；該方法的缺點(diǎn)是逆轉(zhuǎn)錄特異性低，無法精確獲得感興趣的基因，常呈現(xiàn)連續(xù)的模糊帶或較短的產(chǎn)物背景。

去帽法以5'-full?RACE?Kit(TaKaRa?Code:D315)為代表。該方法原理是先利用mRNA的5’末端帽子結(jié)構(gòu)特異性的對基因全長進(jìn)行擴(kuò)增。降解的mRNA?5’端有一個磷酸基團(tuán)，用堿性磷酸酶去掉該磷酸基團(tuán)。再用煙草酸性焦磷酸酶去掉帽子結(jié)構(gòu)，則mRNA?分子的5’末端會暴露出磷酸基團(tuán)，隨后的連接步驟中，錨定引物5’Outer?Primer特異性地加在mRNA?分子的5’末端而不會和降解的mRNA連接。該方法的優(yōu)點(diǎn)是全長分子比例高，非特異性PCR產(chǎn)物較少；該方法的缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，針對mRNA分子操作，增加了mRNA降解的風(fēng)險，對于mRNA?5’末端結(jié)構(gòu)復(fù)雜或二級結(jié)構(gòu)較多的基因，會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，無法獲得目的條帶。