[發明專利]一種用于擴增cDNA 5’末端的通用接頭引物及5’RACE方法

在審

• 申請號: 202211650038.4
• 申請日: 2022-12-21
• 公開（公告）號: CN115976173A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 王冬;熊園
• 申請（專利權）人: 生工生物工程（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 陳秋夢

1.一種用于擴增cDNA?5’末端的通用接頭引物，其特征在于，所述5’末端的接頭引物序列為：GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGIIGGIIGGII?GGIIG，所述通用接頭引物與3’端添加有poly(C)的單鏈cDNA片段的模板配對。

2.一種擴增cDNA末端的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的用于擴增cDNA5’末端的通用接頭引物。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括擴增cDNA?5’末端的錨定引物，所述錨定引物的序列為：GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括逆轉錄酶、逆轉錄引物和巢式引物組；

優選地，所述巢式引物組包括第一巢式引物和第二巢式引物，且所述第一巢式引物用于與所述通用接頭引物組合進行第一輪巢式PCR，所述第二巢式引物與所述錨定引物進行第二輪巢式PCR；

優選地，所述第一巢式引物和第二巢式引物的引物序列長度為23-28nt，且所述第一巢式引物所在的位置和第二巢式引物所在的位置大于20nt。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反應Buffer；所述反應Buffer包括1-1.1M的二甲胂酸鉀，1-1.1M的KCl，200-205mM?Tris-HCl，78-80mM?MgCl₂，10-12mM?DTT，5-6mM?CoCl₂，0.05％-0.06％(v/v)Triton?X-100，其中Tris-HCl的pH為7.8-8.0。

6.一種采用如權利要求2-5任一項所述的試劑盒或權利要求1所述的用于擴增cDNA?5’末端的通用接頭引物獲得完整5’末端序列的5’RACE方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

采用所述5’末端的通用接頭引物擴增3’端添加有poly(C)的單鏈cDNA片段，得到5'末端的RACE產物。

7.根據權利要求6所述的5’RACE方法，其特征在于，所述5’RACE方法包括如下步驟：

逆轉錄：通過逆轉錄引物和逆轉錄酶對目的基因逆轉錄，獲得第一鏈cDNA片段；

RNA降解反應；

在3’端加poly(C)；

第一輪巢式PCR：以所述通用接頭引物和第一巢式引物進行第一輪巢式PCR；

第二輪巢式PCR：以第二巢式引物與錨定引物進行第二輪巢式PCR。

8.根據權利要求7所述的5’RACE方法，其特征在于，所述第一輪巢式PCR的擴增程序包括：94℃預變性1min；94℃變性30s，70℃退火30s，72℃延伸120s，退火溫度每個循環降低1℃，共10個循環；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，共25個循環，72℃延伸1-5min。

9.根據權利要求7所述的5’RACE方法，其特征在于，所述第二輪巢式PCR的擴增程序包括：94℃預變性1min；94℃變性30s，70℃退火30s，72℃延伸120s，退火溫度每個循環降低1℃，共10個循環；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，共25個循環，72℃延伸1-5min。

10.采用如權利要求2-5任一項所述的試劑盒或權利要求1所述的用于擴增cDNA5’末端的通用接頭引物在擴增cDNA中的應用。