[發明專利]一種產糠胺的基因工程菌及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202211645773.6
• 申請日: 2022-12-20
• 公開（公告）號: CN115786226A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 咸漠;劉耀杰;徐超
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/54;C12N15/53;C12P17/04;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 王志新

本發明一種產糠胺的基因工程菌及其制備方法與應用，本發明屬于發酵工程技術領域。本發明為解決現有生物轉氨催化制備糠胺存在氨基供體用量大、價格昂貴、需金屬離子輔因子、輔底物用量大等問題。本發明方法：構建重組大腸桿菌細胞；將誘導表達的重組工程桿菌全細胞加入反應體系；回收全細胞催化劑，制備產品。利用廉價的無機氨基供體，同時利用葡萄糖為輔底物，制備糠胺；有效降低了氨基供體的用量與成本，同時大幅降低了葡萄糖用量，實現生物基糠胺的綠色高效合成。

技術領域

本發明屬于發酵工程技術領域，具體涉及一種產糠胺的基因工程菌及其制備方法與應用。

背景技術

糠胺(2-Furfurylamine，FLA)，又名2-呋喃甲胺，分子式為C5H7NO，是一種無色油狀液體，見光、受熱或暴露在空氣中會吸收CO2而變質，能溶于乙醇等?？钒肥茄苌钥啡┑囊环N伯胺類化合物，在現代化學和工業中具有多種應用，包括聚合物、農藥、生物活性分子的合成以及作為如殺菌劑、膽堿能藥、降壓藥和利尿劑等藥物合成的中間體。目前，糠胺主要合成方法以化學法為主，在高溫高壓的條件下，通過糠醛與液氮進行氫化反應制備，因產物結構特殊，對反應條件要求較為苛刻，后續研究主要圍繞催化劑進行改進。目前，各種貴金屬催化劑(鎳金屬，CN1704411A，糠胺產率85％；Ru金屬，Research on ChemicalIntermediates，2015，42:19-30，糠胺產率60％)均已應用與合成糠胺，但現有的貴金屬催化氫化法存在反應條件苛刻、催化劑成本高、收率低等問題，無法實現糠胺的綠色合成。

生物催化具有選擇性高、催化效率高、反應條件溫和的優勢，例如2017年Alice等(Green Chem，2017，19:397-404)利用源自Chromobacteium violaceum(DSM30191)的轉氨酶(CV-TAMs)催化糠醛制備糠胺，但目前的轉氨反應的氨基供體多為丙氨酸、異丙胺及甲基芐胺等有機胺，其用量大、價格昂貴且部分具有生物致毒性。2021年李清等(Green Chem，2021，23:8154-8168)利用轉氨酶(CV-TAMs)與丙氨酸脫氫酶(AlaDH)在氯化膽堿/乙二醇-水的兩相體系下，利用氯化銨為氨基供體催化合成糠胺，但其級聯催化體系存在需要采用氯化膽堿/乙二醇構建反應溶劑體系、金屬離子輔因子，且需要大量的輔底物葡萄糖。

在此基礎上針對現有生物轉氨催化制備糠胺存在氨基供體用量大、價格昂貴、需金屬離子輔因子、輔底物用量大的問題。

發明內容

本發明的目的是為了提供一種利用重組大腸桿菌全細胞催化糠醛制備糠胺的綠色高效合成方法，利用廉價的無機氨基供體及葡萄糖制備糠胺，克服了現有生物轉氨存在的氨基供體用量大、價格昂貴、需金屬離子輔因子、輔底物用量大的問題。

本發明提供一種產糠胺的基因工程菌，所述基因工程菌過表達轉氨酶基因OATA和丙氨酸脫氫酶基因ALD。

進一步地限定，所述基因工程菌被敲除DNA結合轉錄雙調節因子arcA，并過表達轉氨酶基因OATA、丙氨酸脫氫酶基因ALD和T7啟動子連接碳存儲調節因子CsrB基因。

進一步地限定，所述轉氨酶基因OATA，來源于人蒼白桿菌，基因序列如SEQ IDNO.3所示；所述丙氨酸脫氫酶基因ALD，來源于來源于谷草芽孢桿菌，Genebank ID：936557；csrB基因序列如SEQ ID NO.1所示；DNA結合轉錄雙調節因子arcA的GeneBank ID為QJZ27444.1。

進一步地限定，上述的基因工程菌的出發菌株為大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。

本發明提供上述的基因工程菌的微生物制劑。

本發明提供一種上述的基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述制備方法的具體步驟如下：