[發明專利]一種培養生物干細胞的方法

在審

• 申請號: 202211645196.0
• 申請日: 2022-12-21
• 公開（公告）號: CN116103232A
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發明（設計）人: 倪柏雯
• 申請（專利權）人: 江蘇時代銘陽生物新技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙) 32267
• 代理人: 劉純

一種培養生物干細胞的方法，包括如下步驟：包括如下步驟：S1配備干細胞培養基：每1L?DMEM/F12培養基加入0.1L血清制備出干細胞培養基，封瓶口后，存于4℃溫度條件下備用；S2培養：向干細胞培養基按照0.1?1.0ml/cm量加入臍帶，標記后置于35?40℃、3?6%CO2的培養箱中培養，48h后進行半量換液，以后每3?4d行全量換液，于倒置顯微鏡下觀察干細胞的形態及生長狀況，待干細胞融合達75?85%后進行傳代；S3傳代。本發明所述的培養生物干細胞的方法，是用于培養間充質干細胞，方法簡單，采用臍帶作為干細胞來源，臍帶是一種常規醫療廢棄物，從中分離培養間充質干細胞不存在倫理爭議，還能提高臍帶的利用度，將血清加入DMEM/F12培養基配備干細胞培養基，其高效穩定及增殖分化較好，應用前景廣泛。

技術領域

本發明屬于干細胞培養技術領域，具體涉及一種培養生物干細胞的方法。

背景技術

間充質干細胞是一類廣泛存在于機體組織中的成體干細胞,?具有自我復制、?跨胚層分化和免疫調控的特性,?近年來憑借其豐富多樣的生物功能，成為組織工程、?移植免疫、?基因治療等領域的重要種子細胞，有著廣闊的應用前景。

目前，基礎、?臨床實驗中所用的間充質干細胞多來自骨髓，其他具有間充質分化潛能的干細胞來源包括：臍帶、胎盤、脂肪組織、?臍血、骨骼肌、牙髓、羊水及一些胎兒組織。其中，人臍帶間充質干細胞生物性能穩定，有較高的增殖活性，具有分化潛能大、?免疫原性低、體外生長迅速，免疫調節能力強等優點，并且臍帶作為常規醫療廢棄物，從中分離培養間充質干細胞不存在倫理爭議。因此，本發明的目的是提供一種從臍帶中分離、培養間充質干細胞的方法，特別是提供一種增殖及分化能力最佳的培養體系，提高臍帶這類醫療廢棄物的利用度，以及提高干細胞產量，具有較高的附加值，具有廣泛的應用前景。

發明內容

發明目的：為了克服以上不足，本發明的目的是提供一種培養生物干細胞的方法，方法簡單可控，是用于培養間充質干細胞，方法簡單，采用臍帶作為干細胞來源，臍帶是一種常規醫療廢棄物，從中分離培養間充質干細胞不存在倫理爭議，還能提高臍帶的利用度，將血清加入DMEM/F12?培養基配備干細胞培養基，其高效穩定及增殖分化較好，具有很大的應用價值，應用前景廣泛。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種培養生物干細胞的方法，包括如下步驟：

S1配備干細胞培養基：每1L?DMEM/F12?培養基加入0.1L血清制備出干細胞培養基，封瓶口后，存于?4℃溫度條件下備用；

S2培養：向干細胞培養基按照0.1-1.0ml/cm量加入臍帶，標記后置于35-40℃、3-6%?CO2的培養箱中培養，48h后進行半量換液，以后每?3-4d行全量換液，?于倒置顯微鏡下觀察干細胞的形態及生長狀況，待干細胞融合達75-85%后進行傳代；

S3傳代：采用磷酸緩沖液洗滌上述細胞2-3遍，加入0.25%胰酶，晃動至胰酶完全覆蓋干細胞表面，待干細胞消化完全，再加入另一個干細胞培養基進行終止消化，將干細胞吹打均勻后，轉移至離心管中，離心后棄上清液，再加入另一個干細胞培養基，將干細胞吹打均勻后，轉移至175T?培養瓶中繼續培養，記為?P1?代，在顯微鏡下觀察呈大小均勻的成纖維細胞樣形態；待干細胞長滿175T?培養瓶時，繼續重復上述步驟，傳代至第?2?代，記為?P2代，在顯微鏡下觀察數量較P1?代呈倍數增加，形態多為長細條狀，部分呈多角形，?分布大小均勻，漩渦狀或平行生長；取P2?代的干細胞加入DMEM/F12?培養基繼續培養，記為P3代，在顯微鏡下觀察生長狀態良好。

本發明所述的培養生物干細胞的方法，是用于培養間充質干細胞，采用臍帶作為干細胞來源，臍帶是一種常規醫療廢棄物，從中分離培養間充質干細胞不存在倫理爭議，還能提高臍帶的利用度。將血清加入DMEM/F12?培養基配備干細胞培養基，其高效穩定及增殖分化較好，可以促進?RNA、蛋白質和脂肪酸合成，?進一步促進營養物質的吸收，抑制干細胞凋亡，從而促進間充質干細胞的增殖。