[發(fā)明專利]一種培養(yǎng)生物干細胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211645196.0
• 申請日: 2022-12-21
• 公開（公告）號: CN116103232A
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 倪柏雯
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇時代銘陽生物新技術(shù)研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32267
• 代理人: 劉純

1.一種培養(yǎng)生物干細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1配備干細胞培養(yǎng)基：每1L?DMEM/F12?培養(yǎng)基加入0.1L血清制備出干細胞培養(yǎng)基，封瓶口后，存于?4℃溫度條件下備用；

S2培養(yǎng)：向干細胞培養(yǎng)基按照0.1-1.0ml/cm量加入臍帶，標記后置于35-40℃、3-6%?CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后進行半量換液，以后每?3-4d行全量換液，?于倒置顯微鏡下觀察干細胞的形態(tài)及生長狀況，待干細胞融合達75-85%后進行傳代；

S3傳代：采用磷酸緩沖液洗滌上述細胞2-3遍，加入0.25%胰酶，晃動至胰酶完全覆蓋干細胞表面，待干細胞消化完全，再加入另一個干細胞培養(yǎng)基進行終止消化，將干細胞吹打均勻后，轉(zhuǎn)移至離心管中，離心后棄上清液，再加入另一個干細胞培養(yǎng)基，將干細胞吹打均勻后，轉(zhuǎn)移至175T?培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，記為?P1?代；待干細胞長滿175T?培養(yǎng)瓶時，繼續(xù)重復(fù)上述步驟，傳代至第?2?代，記為?P2?代；取P2?代的干細胞加入DMEM/F12?培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，記為P3代。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)生物干細胞的方法，其特征在于，所述血清包括胎牛血清、成人血清、臍帶血清。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)生物干細胞的方法，其特征在于，所述胎牛血清需要采用0.22μm?針頭濾器進行過濾；所述成人血清是在無菌條件下從健康成人抽取外周血，室溫放至自凝狀態(tài)，待凝固后，在無菌條件下在超凈工作臺中移入離心管、水平離心后，取上面黃色清亮部分，并且加入DMEM/F12?培養(yǎng)基前需要在56℃溫度條件下水浴?30min進行滅活補體；所述臍帶血清是在無菌條件下從健康足月兒抽取臍帶血，室溫放至自凝狀態(tài)，待凝固后，在無菌條件下在超凈工作臺中移入離心管、水平離心后，取上面黃色清亮部分，并且加入DMEM/F12?培養(yǎng)基前需要在56℃溫度條件下水浴?30min進行滅活補體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)生物干細胞的方法，其特征在于，所述臍帶采集后，先采用磷酸緩沖液反復(fù)沖洗至干凈，然后在4℃溫度下保存，并且在6h內(nèi)進行分離、剪碎。

5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)生物干細胞的方法，其特征在于，所述磷酸緩沖液含有青霉素、鏈霉素。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)生物干細胞的方法，其特征在于，所述分離、剪碎，具體包括如下內(nèi)容：將臍帶的動靜脈和臍帶外膜去除，剝離華通膠，剪成均勻碎粒，然后平鋪至培養(yǎng)基中。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)生物干細胞的方法，其特征在于，所述0.25%胰酶的配方為每1L磷酸緩沖液加入2.5g胰酶。