[發(fā)明專利]一種杧果胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法

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• 申請日: 2022-12-20
• 公開（公告）號: CN115772537A
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 叢漢卿;王明珠;陳業(yè)淵;喬飛;霍婷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N5/04;C12N5/00;A01H4/00
• 代理公司: 廣州海心聯(lián)合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44295
• 代理人: 王洪娟

本發(fā)明公開了一種杧果胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：(S1)取杧果果核中的胚軸組織接種至愈傷培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；(S2)將愈傷組織轉(zhuǎn)移至液體增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，獲得杧果胚性懸浮細(xì)胞；(S3)制備農(nóng)桿菌重懸液；(S4)將杧果胚性懸浮細(xì)胞經(jīng)預(yù)處理；(S5)將預(yù)處理杧果胚性懸浮細(xì)胞與農(nóng)桿菌重懸液混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，將轉(zhuǎn)化后的懸浮細(xì)胞先接種至Paul固體培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移至含有潮霉素、頭孢噻肟和植物凝膠的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，獲得杧果胚性細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化體系。該方法通過建立杧果胚性細(xì)胞培養(yǎng)系，用杧果胚性細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體，建立高效及適應(yīng)性廣的杧果遺傳轉(zhuǎn)化體系。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物組培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種杧果胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

杧果(Mangifera India L.)起源于古印度，生長在世界上大多數(shù)熱帶地區(qū)，是目前最重要的熱帶經(jīng)濟作物之一。杧果是漆樹科(Anacardiaceae)杧果屬(Mangifera)(英文名mango，中文又名芒果、檬果)，被譽為“熱帶果王”，僅次于柑橘、蕉類、葡萄、蘋果，居世界水果第五位，我國杧果2019年種植面積32.3萬hm²，居世界第三位。果實形態(tài)美觀，色澤誘人，果肉質(zhì)地細(xì)滑多汁，香味獨特，風(fēng)味濃郁，營養(yǎng)豐富，極受消費者歡迎。但是杧果樹具有生命周期長、異花授粉、雜合性強等特點，利用常規(guī)育種進(jìn)行改良難度較大。

杧果是世界上種植最廣泛的熱帶果樹之一，可是目前生產(chǎn)上栽培的許多杧果品種品質(zhì)優(yōu)良但抗病性較差。體細(xì)胞胚再生體系(somatic embryogenesis,SE)是杧果植株再生最為有效的再生途徑(Krishna and Singh,2007)。也是利用生物技術(shù)開展杧果抗性分子育種的重要平臺(Litz et al.,1991；Jayasankar and Litz,1998)。杧果的體細(xì)胞胚發(fā)生主要是通過間接發(fā)生途徑，多是以珠心外植體脫分化誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織再分化誘導(dǎo)出原胚團，原胚團能增殖或發(fā)育形成早期體細(xì)胞胚(如球形胚，心形胚)，從而進(jìn)一步發(fā)育為成熟體細(xì)胞胚(如子葉胚)(Litz et al.,1982；Litz,1984；Dewald et al.,1989；Krishnaand Singh,2007；黃鏡浩等,2009)。國外首次報道是1982年Litz R.E.對自然多胚杧果胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)，獲得了體細(xì)胞胚(Litz R.E.et al，1982)；1984年Litz R.E.又從自然多胚杧果Chino和Ono及幾種單胚杧果的珠心細(xì)胞誘導(dǎo)出愈傷組織并進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，這一研究為再生杧果植株奠定了基礎(chǔ)(Litz R E.et al,1984；Litz R E.et al,1984)。

近十幾年來植物基因工程的研究進(jìn)展十分迅速。在植物抗病、抗蟲、抗除草劑貯存與保鮮和改變植物的某些成分方面都已得到了不少轉(zhuǎn)基因植株，有的已經(jīng)建成了品系，為提高作物的產(chǎn)量，抗逆能力，改進(jìn)它們的品質(zhì)，進(jìn)行快速、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)產(chǎn)的育種選育提供了一條誘人的全新途徑。這些新技術(shù)能否在作物改良上成功利用，首先取決于能否建立適合基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞懸浮系。杧果的細(xì)胞組織培養(yǎng)可以為杧果的轉(zhuǎn)基因提供材料，并在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了體細(xì)胞胚胎發(fā)生。作為當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)和農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的主要載體，卻由于品種的特異性使得該體系存在胚性愈傷誘導(dǎo)率和植株轉(zhuǎn)化率低的問題。因此，建立成熟的ECS(胚性細(xì)胞懸浮系)和遺傳轉(zhuǎn)化體系在杧果品種的遺傳改良中都具有重要的理論意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種杧果胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，該方法通過建立杧果胚性細(xì)胞培養(yǎng)系，用杧果胚性細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體，建立高效及適應(yīng)性廣的杧果遺傳轉(zhuǎn)化體系。

本發(fā)明的上述目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種杧果胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：

(S1)以未成熟的杧果果實作為外植體，將所述外植體消毒后取杧果果核中的胚組織接種至愈傷培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得愈傷組織；

(S2)將愈傷組織轉(zhuǎn)移至液體增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，獲得杧果胚性懸浮細(xì)胞；