[發明專利]一種杧果胚性細胞的遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 202211644612.5
• 申請日: 2022-12-20
• 公開（公告）號: CN115772537A
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 叢漢卿;王明珠;陳業淵;喬飛;霍婷
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N5/04;C12N5/00;A01H4/00
• 代理公司: 廣州海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 王洪娟

1.一種杧果胚性細胞的遺傳轉化方法，其特征是包括以下步驟：

(S1)以未成熟的杧果果實作為外植體，將所述外植體消毒后取杧果果核中的胚軸組織接種至愈傷培養基中進行培養，獲得愈傷組織；

(S2)將愈傷組織轉移至液體增殖培養基中進行繼代增殖培養，獲得杧果胚性懸浮細胞；

(S3)將農桿菌在固體板上劃線培養，挑取單菌落，接種至含有卡那霉素和利福平的LB液體培養基中進行活化培養，將活化好的菌液接種至LB液體培養基中培養后，離心，棄上清，加入含有乙酰丁香酮的Paul培養基重懸，得農桿菌重懸液；

(S4)將步驟(S2)中的杧果胚性懸浮細胞用Paul培養基清洗，然后加入含有乙酰丁香酮的Paul培養基，混勻，得預處理杧果胚性懸浮細胞；

(S5)將步驟(S4)中預處理杧果胚性懸浮細胞與步驟(S3)中農桿菌重懸液混合進行轉化培養，將轉化后的懸浮細胞先接種至Paul固體培養基中進行暗培養，然后再轉移至含有潮霉素、頭孢噻肟和植物凝膠的Murashige和Skoog培養基中進行選擇培養，獲得杧果胚性細胞遺傳轉化體系。

2.根據權利要求1所述的杧果胚性細胞的遺傳轉化方法，其特征是：步驟(S1)中所述愈傷培養基為添加有0.5～3mg/L 2,4-D、0.5～3mg/L玉米素，3.0％,w/w蔗糖和0.25％～0.30％,w/w植物凝膠的Murashige和Skoog固體培養基；培養條件為25～28℃、pH為5.8～5.9、黑暗，培養時間為40～60天。

3.根據權利要求1所述的杧果胚性細胞的遺傳轉化方法，其特征是：步驟(S2)中所述液體增殖培養基為添加有2～3mg/L 2,4-D、1～3mg/L玉米素、3.0～4.0％,w/w蔗糖的Murashige和Skoog液體培養基上進行培養；培養條件為25℃、pH為5.8～5.9、150～220rpm進行震蕩黑暗培養，每5～7天繼代一次。

4.根據權利要求1所述的杧果胚性細胞的遺傳轉化方法，其特征是：步驟(S3)中所述農桿菌為LBA4404；步驟(S3)中所述卡那霉素的濃度為100～200mg/L，所述利福平的濃度為20～30mg/L；培養條件為150～220rpm下震蕩培養，培養條件為28～30℃、黑暗培養16～20小時。

5.根據權利要求1所述的杧果胚性細胞的遺傳轉化方法，其特征是：步驟(S3)中將活化好的菌液接種至LB液體培養基中培養，培養條件為28～30℃，150～220rpm，震蕩培養至OD600＝0.5～0.7；離心時轉速為8000rpm/min，離心時間為8～10分鐘；所述乙酰丁香酮的加入量為10～20μL，濃度為50～100μmol/L。

6.根據權利要求1所述的杧果胚性細胞的遺傳轉化方法，其特征是：步驟(S3)中～(S4)中所述Paul培養基為含有10％，w/w蔗糖的Murashige和Skoog培養基。

7.根據權利要求1所述的杧果胚性細胞的遺傳轉化方法，其特征是：步驟(S4)中用800～1000mL含有10％，w/w蔗糖的Murashige和Skoog培養基清洗，每次用200～300mL，清洗4～5次；然后加入15～20mL含有乙酰丁香酮的Paul培養基，混勻，其中所述乙酰丁香酮的加入量為10～20μL，濃度為50～100μmol/L。

8.根據權利要求1所述的杧果胚性細胞的遺傳轉化方法，其特征是：步驟(S5)中所述預處理杧果胚性懸浮細胞與農桿菌重懸液的體積比為5～8：0.18～0.2；培養條件為在150～220rpm/min的搖床上培養10～15min。

9.根據權利要求1所述的杧果胚性細胞的遺傳轉化方法，其特征是：步驟(S5)中將轉化后的懸浮細胞先接種至Paul固體培養基中進行暗培養時，培養條件為在22～25℃黑暗中培養36～48小時。

10.根據權利要求1所述的杧果胚性細胞的遺傳轉化方法，其特征是：步驟(S5)中再轉移至含有60～100mg/L潮霉素、100～300mg/L頭孢噻肟和0.25％～0.30％，w/w植物凝膠的Murashige和Skoog培養基中進行選擇培養；培養條件為25～30℃、避光培養。