[發明專利]用于猴痘病毒檢測的crRNA、核酸分子組合物、檢測體系及應用

在審

• 申請號: 202211628896.9
• 申請日: 2022-12-18
• 公開（公告）號: CN115820939A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 杜丹;王瀟;湯有志;陸正榮;饒巧;王瑞
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/113;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廈門律嘉知識產權代理事務所(普通合伙) 35225
• 代理人: 張輝

本發明公開了一種用于猴痘病毒檢測的crRNA、核酸分子組合物、檢測體系及應用，所述crRNA包括至少一組如SEQ ID NO 1?6所示核苷酸序列。核酸分子組合物包括crRNA和RAA引物對，所述crRNA包括SEQ ID NO 1?6所示的核苷酸序列。本發明檢測體系為CRISPR?Cas12檢測體系或CRISPR?Cas13檢測體系或CRISPR?Cas12?Cas13雙通道檢測體系。本發明基于猴痘病毒基因，設計了猴痘病毒特異性crRNA，同時結合CRISPR?Cas熒光/適配體檢測系統，可以短時間檢測出是否存在猴痘病毒，能特異性區分不同亞型的猴痘病毒，且操作方便，不需要精密的儀器，特異性好、靈敏度高，最低檢測限可達4copies。本發明建立的CRISPR?Cas12?Cas13雙通道檢測體系可檢測在一個樣本中除了猴痘病毒外是否帶有其它病毒，進一步豐富了檢測內容。

技術領域

本發明涉及病原檢測技術領域。更具體地，涉及一種用于猴痘病毒檢測的crRNA、核酸分子組合物、CRISPR-Cas檢測體系及試劑盒。

背景技術

猴痘是一種由正痘病毒引起的人畜共患疾病，會導致人類患上類似天花的疾病。感染猴痘的早期癥狀包括發熱、頭痛、肌肉疼痛、淋巴結腫大、發冷和疲倦，其后身上出現類似水泡的皮疹并愈合。加強對猴痘病例的監測和檢測是了解這種疾病不斷變化的流行病學的重要工具。

CRISPR-Cas系統廣泛存在于細菌和古細菌中，構成了針對外來入侵核酸的獲得性免疫系統，其防御過程包括三個階段：間隔序列獲取，合成crRNA和靶標干擾。通常，CRISPR-Cas系統由CRISPR RNA(crRNA)和Cas蛋白組成，crRNA與靶序列互補，可引導Cas蛋白進行序列特異性識別和切割。

其中CRISPR-Cas系統中Cas12和Cas13系統，跟Cas9系統不同，Cas12和Cas13蛋白具有反式切割活性，蛋白在crRNA的引導下特異性地靶向雙鏈DNA/單鏈RNA(dsDNA/RNA)并激活其反式切割活性，不加區別的切割非特異性單鏈DNA/RNA(ssDNA/ssRNA)。Cas12系統識別雙鏈DNA，反式切割識別單鏈DNA；Cas13系統識別RNA，反式切割識別的也是RNA。有研究發現，靶向的RNA濃度為1～10p mol/L時，僅0.02％Cas13a系統被激活，而剪切效率卻可達到25％～50％，每個靶向剪切將會導致后續更多的非特異性靶向剪切活性，對信號進行了放大，可在短時間內檢測到特異性增強的熒光信號。因此Cas12和Cas13系統在檢測領域迅速發展起來。

病毒的診斷包括臨床診斷和實驗室診斷，由于猴痘病毒復雜的情況，目前確證猴痘的最有效途徑就是進行實驗室診斷，常用的方法包括病原學診斷、血清診斷法、分子生物學診斷方法等。最傳統的檢測方式是病毒分離法，但該方法耗時實驗周期長。目前已有的快速檢測方法是實時熒光PCR法，但探針購買昂貴，且需依賴一套復雜的熱循環系統才能達到擴增核酸的目的，無法運用于即時診斷。相較于此，新的等溫擴增技術的優勢便突顯出來，已成為一種有應用前景的現場檢測方法。重組酶介導等溫核酸擴增技術(RAA)，可實在恒溫條件下短時間內對樣品進行大量的擴增，操作簡單，不受儀器的限制。但當模板濃度低時，可出現非特異性擴增，容易產生假陽性情況。

發明內容

為了克服現有技術的缺陷，本發明的目的之一在于提供一種用于猴痘病毒檢測的crRNA及核酸分子組合物，可與猴痘病毒的DNA/RNA結合，從而進行檢測。本發明的目的之二在于提供猴痘病毒檢測CRISPR-Cas檢測體系，可以短時間檢測出是否存在猴痘病毒，能特異性區分不同亞型的猴痘病毒。

為實現上述目的，本發明公開了一種用于猴痘病毒檢測的crRNA，所述crRNA包括至少一組如SEQ ID NO 1-6所示核苷酸序列。

進一步的，所述crRNA包括SEQ ID NO 1-6所示的核苷酸序列。