[發明專利]用于檢測EGFR基因的引物探針組合及試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202211624041.9
• 申請日: 2022-12-16
• 公開（公告）號: CN115838807A
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 王會敏;徐容;葛光君;趙嘉麗;王云沁;黃藝萌
• 申請（專利權）人: 臻準生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 聶月美;許亦琳

本發明公開了用于檢測EGFR基因的引物探針組合及試劑盒和方法。所述引物探針組合包括用于檢測T790M的突變型引物和突變型探針，以及野生型探針；所述突變型引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列；所述突變型探針的序列包括如SEQ ID NO.3所示序列；所述野生型探針的序列包括如SEQ ID NO.4所示序列。本發明通過T790M突變型的探針和野生型的探針聯合，能檢測到T790M位點的單獨分型，且靈敏度、準確性均比較高，能檢測到腫瘤組織各處來源的T790M異常基因，提供了一種無創性腫瘤診斷的新方法，也為腫瘤早期診斷提供了新的希望。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及用于檢測EGFR基因的引物探針組合及試劑盒和方法。

背景技術

表皮生長因子受體(EGFR)基因突變是東亞人群中非小細胞肺癌(NSCLC)最常見的驅動基因突變，突變率為30％～40％。既以往多項研究支持EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療是EGFR基因突變局部晚期或轉移NSCLC患者的標準治療方案，但幾乎所有服用EGFR-TKI的患者最終都會出現耐藥，其中EGFR基因第20號外顯子發生錯義突變，20號外顯子第790號位置上的甲硫氫酸(M)替代蘇氨酸(T)(T790M突變)是耐藥突變中最主要的類型。目前已報道的EGFR-TKI耐藥后組織樣本的T790M突變陽性率基本在60％左右，血漿樣本T790M突變陽性率基于不同方法差別較大，在23％～63％。目前，美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)、歐洲臨床腫瘤協會(ESMO)指南、中國臨床腫瘤學會(CSCO)原發性肺癌診療指南均推薦奧希替尼為局部晚期或轉移NSCLC EGFR-TKI耐藥后T790M突變陽性患者的標準治療。EGFR基因T790M突變檢測對EGFR-TKI耐藥的晚期NSCLC患者后續治療具有重要的臨床指導意義。

目前基因突變常用的檢測方法包括：sanger測序法、熒光PCR法、高分辨溶解曲線法、高通量測序法等。sanger測序法過程操作繁瑣、耗時長，且對取材和技術要求比較高，并且由于自身的限制導致其靈敏度不高，僅可檢測豐度超過20％的突變，假陰性較多。高通量測序法價格昂貴，讀長大約30-250bp，比Sanger測序短，對序列拼接造成了負擔，檢測結果仍需要Sanger測序驗證，并且對于檢測外顯子與內含子交界區的小片段缺失的準確性不夠。高通量測序法操作繁瑣，限制了測序速度。傳統熒光PCR法操作簡單，能極大的避免擴增產物的污染。但該方法不能實現精準定量，尤其是低豐度突變。

數字PCR(digital PCR，dPCR)技術，即通過將一個樣本分成大量等份，然后分配到不同的獨立反應，每個獨立反應單元至少包含一個拷貝的目標分子(核酸模板)，在每個獨立反應的中分別對目的模板分子進行PCR擴增，然后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。目前數字PCR主要在癌癥標志物、稀有突變檢測、致病微生物檢測、基因表達分析以及拷貝數變異分析等科研領域有較廣泛的應用，同時也可以與高通量測序無縫對接，驗證測序結果。

市面已有試劑盒的問題(圖1)：1)FAM通道存在非特異性擴增；2)陰陽性區分不明顯；3)標準品中陽性與非特異性熒光值條帶合并，突變比例錯誤。

為了解決現有技術中存在的問題，因此急需要一種特異性檢測EGFR基因的引物探針組合、試劑盒，防止PCR產物造成的假陽性，并提高檢出的特異性和準確性。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供檢測EGFR基因的引物探針組合及試劑盒和方法，以期解決現有技術中Taqman探針在特異性結合目的序列時無法達到100％的特異性結合，導致無法精準判斷是否存在基因突變，以及cfDNA成分復雜、目的核酸含量低等特點，導致靶基因濃度低于檢測限時能造成假陰性結果的問題。

為實現上述目的，本發明具體采用如下技術方案。

本發明的第一方面保護檢測EGFR基因的引物探針組合，包括用于檢測T790M的突變型引物和突變型探針，以及野生型探針；