[發明專利]一種無模板DNA酶促合成方法

在審

• 申請號: 202211622358.9
• 申請日: 2022-12-16
• 公開（公告）號: CN116355979A
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發明（設計）人: 賀建奎;李周芳;徐國偉
• 申請（專利權）人: 賀建奎
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N15/10
• 代理公司: 深圳市惠邦知識產權代理事務所 44271
• 代理人: 李清

本發明涉及一種無模板DNA酶促合成方法，包括將TdT酶和引發鏈分別固定在反應面板上的反應孔底部，調節第一反應緩沖液的pH值，使所述TdT酶完全沒有催化活性，所述TdT酶的結合結構域不受影響；加入單一、設定量、預設的脫氧核苷酸，所述脫氧核苷酸與第二反應緩沖液混合加入，讓脫氧核苷酸擴散到反應孔中，并且讓TdT酶反應位置上只結合一個dNTP，此時TdT酶是非活性狀態且不進行催化連接反應，dNTP只是占據了TdT酶的結合結構域以防止多余的dNTP連接到該位置；用第三反應緩沖液沖洗掉所有沒有結合上去的dNTP，然后更換第四反應緩沖液，使TdT酶激活，從而催化dNTP連接反應開啟，一個核苷酸就被成功加到了DNA反應鏈的末端，繼續下一個循環。本發明可以延伸DNA鏈超過300nt。

技術領域

本發明涉及DNA合成領域，特別涉及一種無模板DNA酶促合成方法。

背景技術

近年來，合成生物學在醫療、化工、農業及信息等交叉融合領域實現快速發展，極大地提高了人類探索生命本質并改造利用的能力，作為生命科學基礎的DNA合成是合成生物學的基礎性技術。DNA，包括DNA藥物，DNA存儲等都是研究的熱門領域。RNA方面，最主要包括mRNA疫苗和mRNA藥物等，對mRNA疫苗的需求催生了這個領域的快速發展，所以對RNA合成技術也提出了新需求另一方面，mRNA疫苗的開發和成果又讓更多的人發現mRNA療法在其他重要的疾病中的潛在應用價值。所以DNA合成和RNA合成技術受到了各國政府和資本的重視，各種新技術噴涌而出，尤其對于綠色的酶促合成更是下一個10年的重點發展對象。

簡而言之，DNA酶促合成進行的如火如荼，目前代表公司主要有MolecularAssemblies，DNA?script，Ansa?biotechnology等。

三代基于生物酶法合成技術(如TdT酶合成法)由于反應條件溫和，準確率高，又相對環保，從2008年開始就陸續在歐美國家出現一系列產業布局，但總體仍處于原理驗證階段，尚未出現商業化設備。國內對該領域的布局較晚，截止目前為止，只有天津工業生物技術研究所和天津科技大學生物工程學院，湖南大學目前有TdT酶相關的DNA合成技術研發報道(Ref：彭凱等，DNA合成、組裝與糾錯技術研究進展)，到目前為止沒有人在研發生物酶DNA合成儀設備。國際上，目前主流生物酶法合成公司包括Molecular?Assemblies,Nuclera,DNA?Script,Ansa?Biotechnoligies等，基本都是基于TdT酶(末端脫氧核苷酸轉移酶)，由于TdT酶合成無需依賴模板，僅使用單鏈DNA即可進行DNA合成，所以具有從頭創造基因組材料的功能，使得他成為三代DNA合成的關鍵生物酶。合成策略方面，主要通過修飾核苷酸，添加特定化學基團的試劑來終止反應，或者偶聯TdT酶與核苷酸等。三代合成技術存在的問題包括前期修飾和制備原料工藝流程復雜，有些成分改造難度大，無法嚴格控制堿基的添加和終止等，還在進一步優化改造階段。

其中，Ansa?Biotechnoligies公司則使用TdT-dNTP復合物來主導天然堿基的原位合成。相比于MolecularAssemblies等公司，其使用的是天然dNTP-TdT的偶聯物，由于空間位阻的原因，當一個dNTP倍加到合成鏈的末端以后，由于空間位阻的原因，下一個dNTP就進不來，反應就會停下來，如此就能根據反應預設的，一個一個往后添加設計的核苷酸序列。但是這個方案最大的弊端是TdT酶消耗量太大了，因為當dNTP結合上去以后，需要去偶聯，把TdT酶去掉。