[發明專利]一種無模板DNA酶促合成方法

在審

• 申請號: 202211622358.9
• 申請日: 2022-12-16
• 公開（公告）號: CN116355979A
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發明（設計）人: 賀建奎;李周芳;徐國偉
• 申請（專利權）人: 賀建奎
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N15/10
• 代理公司: 深圳市惠邦知識產權代理事務所 44271
• 代理人: 李清

1.一種無模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)將TdT酶和引發鏈分別固定在反應面板上的反應孔底部，調節第一反應緩沖液的pH值，使所述TdT酶完全沒有催化活性，所述TdT酶的結合結構域不受影響；

(2)加入單一、設定量、預設的脫氧核苷酸，所述脫氧核苷酸與第二反應緩沖液混合加入，讓脫氧核苷酸擴散到反應孔中，并且讓TdT酶反應位置上只結合一個dNTP，此時TdT酶是非活性狀態且不進行催化連接反應，dNTP只是占據了TDT酶的結合結構域以防止多余的dNTP連接到該位置；

(3)用第三反應緩沖液沖洗掉所有沒有結合上去的dNTP，然后更換第四反應緩沖液，使TdT酶激活，從而催化dNTP連接反應開啟，一個核苷酸就被成功加到了DNA反應鏈的末端，繼續下一個循環。

2.根據權利要求1所述的無模板DNA酶促合成方法，其特征在于：所述第一反應緩沖液為pH4.5～pH6.0或者pH8.0～pH10.0的50mmol/L的Tris-HCl；所述第二反應緩沖液，由pH＝8.9的50mmol/L的Tris-HCl、0.25mg/ml的BSA、體積份數為5份的DMSO、和1.5mM的MgCl₂組成；所述第三反應緩沖液，由pH為8.0的100mmol/L的Tris-HCI、pH為8.0的20mmol/L的EDTA和1.4mol/L的NaCl組成；所述第四反應緩沖液由pH為7.2的0.2mol/L的二甲胂酸鉀、10mM的MgO₄C₄H₆、1mM的2-巰基乙醇、0.5mg/ml的BSA、1mM的dNTP組成。

3.根據權利要求1所述的無模板DNA酶促合成方法，其特征在于：步驟(1)中所述反應面板上設置若干個反應孔，所述反應孔直徑范圍在1.5微米-2.5微米，每個反應孔可以固定多個TdT酶分子進行反應，所述反應孔在反應面板上形成矩陣排列，所述反應面板上含有多個反應孔矩陣。

4.根據權利要求3所述的無模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述反應孔底部布設涂層，所述涂層材料為含有羧基的聚甲基丙烯酸，在反應孔底部連接上一個生物素，在所述生物素分子鏈的末端修飾化學活性基團以取代生物素分子鏈末端的羧基，所述化學活性基團可以為羥基，所述生物素與反應孔底部涂層材料通過羧基和羥基的酯化反應而修飾在反應孔底部；然后將親和素家族分子的一個結合位點與反應孔中的生物素結合，另一結合位點與TdT酶結合。

5.根據權利要求4所述的無模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述生物素為維生素H，其結構式為

6.根據權利要求4所述的無模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述親和素可以為鏈霉親和素、中性親和素。

7.根據權利要求1所述的無模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述步驟(1)中調節第一反應緩沖液的pH值為4.5-6.0或者8.0-10.0。

8.根據權利要求1所述的無模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述步驟(3)中第四反應緩沖液的pH值為6.5-7.5。

9.根據權利要求1-8任一項所述的無模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述反應孔底部材料為玻璃纖維，將反應孔底部帶上可控的正電荷，由于DNA帶負電荷，從而帶正電荷的玻璃纖維吸附住帶負電荷的DNA，所述正電荷的電量大小根據核苷酸延伸可調節，每完成一輪新的合成，帶正電荷的反應孔吸附住延伸中的DNA鏈，而單個核苷酸由于帶電量比較小，將被反應緩沖液沖洗時沖走；在沖洗過程中，加大電壓、電流，提高反應產物結合在底部的力量，耐受比較嚴苛的生化反應和沖洗方式。

10.根據權利要求4所述無模板DNA酶促合成方法，其特征在于，引發鏈為一個長度大于3nt并且小于100nt末端帶有羥基的引發鏈，所述引發鏈為(T)n、(A)n、(C)n、(G)n，其中T代表脫氧胸腺嘧啶核苷酸，簡稱脫氧胸苷，A代表脫氧腺嘌呤核苷酸簡稱脫氧腺苷，C代表脫氧胞嘧啶核苷酸簡稱脫氧胞苷，G代表脫氧鳥嘌呤核苷酸，簡稱脫氧鳥苷，n范圍為3～100；所述帶有羥基的引發鏈與反應孔底部涂層材料通過羧基和羥基的酯化反應而修飾在反應孔底部；每個反應孔中將TDT酶和引發鏈按一定比例20:1～5:1固定在反應孔底部，使多個TDT酶圍繞一個引發鏈，使引發鏈接觸到TDT酶催化中心，從而使每個反應孔底部的引發鏈獲得TdT酶的催化反應。