[發明專利]基于細菌表達的dsRNA防治赤擬谷盜的方法及其應用

在審

• 申請號: 202211620948.8
• 申請日: 2022-12-16
• 公開（公告）號: CN116218919A
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 汪芳;黨聰;葉恭銀;鐘馥駿;方琦;姚洪渭
• 申請（專利權）人: 浙江大學;杭州師范大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/113;C12Q1/6888;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.dsRNA重組表達載體的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

1)、利用L4440質粒制備獲得L4440線性化載體；

2)、獲得赤擬谷盜的靶標基因；

3)、將L4440線性載體和赤擬谷盜靶標基因片段進行同源重組，將同源重組所得產物轉化到HT115感受態細胞，得到表達赤擬谷盜靶標基因dsRNA的重組載體。

2.根據權利要求1所述的dsRNA重組表達載體的構建方法，其特征在于：

當赤擬谷盜的靶標基因為TcCht10-1時，得到L4440-TcCht10-1重組質粒；

當赤擬谷盜的靶標基因為TcCht10-2時，得到L4440-TcCht10-2重組質粒；

當赤擬谷盜的靶標基因為TcPara-1時，得到L4440-TcPara-1重組質粒；

當赤擬谷盜的靶標基因為TcPara-2時，得到L4440-TcPara-2重組質粒；

當赤擬谷盜的靶標基因為TcSnf7時，得到L4440-TcSnf7重組質粒；

當赤擬谷盜的靶標基因為TcVATP-C時，得到L4440-TcVATP-C重組質粒。

3.靶標基因dsRNA粗提液的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)、將表達赤擬谷盜靶標基因dsRNA的重組載體接種于LB培養基(Amp⁺，Tet⁺)中，37℃、250rpm振蕩培養過夜；

2)、將步驟1)中培養過夜的菌液以1：100的體積接種于含有Amp和Tet的雙抗2×YT培養基中，在37℃、250rpm的搖床中至OD600≈0.4；

3)、在步驟2)中獲得的菌液中加入無菌IPTG至終濃度為0.4mM，在37℃、250rpm的搖床中誘導4h；

4)、采用乙醇固定法對步驟3)中已誘導表達的大腸桿菌進行RNA粗提，得到靶標基因dsRNA粗提液。

4.對赤擬谷盜具有防治效果的靶標基因的篩選方法，其特征在于包括以下步驟：

將靶標基因dsRNA粗提液與赤擬谷盜人工飼料混合后，對赤擬谷盜三齡幼蟲進行喂養，10天后進行存活率和相關基因的相對表達量的檢測；

以存活率降低以及靶標基因轉錄水平降低作為赤擬谷盜防控dsRNA片段的篩選標準。