[發(fā)明專利]基于細菌表達的dsRNA防治赤擬谷盜的方法及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211620948.8
• 申請日: 2022-12-16
• 公開（公告）號: CN116218919A
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發(fā)明（設計）人: 汪芳;黨聰;葉恭銀;鐘馥駿;方琦;姚洪渭
• 申請（專利權）人: 浙江大學;杭州師范大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/113;C12Q1/6888;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術領域，涉及一種基于細菌表達的dsRNA用于防治赤擬谷盜的方法。本發(fā)明公開了一種dsRNA重組表達載體的構建方法，包括以下步驟：利用L4440質粒制備獲得L4440線性化載體；獲得赤擬谷盜的靶標基因；將L4440線性載體和赤擬谷盜靶標基因片段進行同源重組，將同源重組所得產(chǎn)物轉化到HT115感受態(tài)細胞，得到表達赤擬谷盜靶標基因dsRNA的重組載體。本發(fā)明還公開了對赤擬谷盜具有防治效果的靶標基因的篩選方法：將靶標基因dsRNA粗提液與赤擬谷盜人工飼料混合后，對赤擬谷盜三齡幼蟲進行喂養(yǎng)，以存活率降低以及靶標基因轉錄水平降低作為赤擬谷盜防控dsRNA片段的篩選標準。

技術領域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術領域，涉及一種基于細菌表達的dsRNA用于防治赤擬谷盜的方法。

背景技術

赤擬谷盜Tribolium?castaneum，屬鞘翅目、擬步甲科、擬谷盜屬，是一種重要的儲糧害蟲，可危害小麥、水稻、玉米、高粱等多種作物。在取食危害糧谷的同時，還會分泌臭液污染糧谷造成無法食用，帶來嚴重的經(jīng)濟損失。目前，赤擬谷盜的防治大多是采用化學農(nóng)藥熏蒸，開發(fā)新型綠色高效的赤擬谷盜防治方法，將助力保障我國的糧食安全。RNA干擾技術由于其高特異性和低環(huán)境污染性可以為農(nóng)作物害蟲防治提供新的思路和途徑。同時，赤擬谷盜被認為是一種較好的開展RNA干擾研究的模式生物。

通過dsRNA飼喂的方法，可以大量篩選用于赤擬谷盜防治的dsRNA片段。但是在dsRNA飼喂時，外源干擾RNA在被昆蟲取食攝入的過程中，會有一部分被消化道或中腸的核酸酶降解，可能會影響其基因沉默效率(Christiaens?and?Smagghe,2014)。因此其為達到一定的基因沉默效果，需要大量的人工合成的干擾RNA。為降低干擾RNA合成的成本，有研究者開發(fā)了可以大量轉錄dsRNA的大腸桿菌系統(tǒng)，構建的重組載體L4440含有T7雙向啟動子序列，將靶標基因通過同源重組至T7啟動子序列中間，在RNase?III缺陷的大腸桿菌HT115(DE3)中經(jīng)IPTG誘導，可以大量產(chǎn)生靶標基因的dsRNA(Timmons?et?al.,2001)。基于大腸桿菌的dsRNA轉錄系統(tǒng)由于其方便快捷及低成本，近年來開始應用于昆蟲RNA干擾研究中(Lüet?al.,2021；Ma?et?al.,2020)。但目前仍未有該dsRNA表達系統(tǒng)在赤擬谷盜上的研究報道，同時現(xiàn)有關于赤擬谷盜的RNAi研究多是基于dsRNA注射的方式完成的，采用dsRNA飼喂的研究較少，而應用dsRNA防治赤擬谷盜最便捷的途徑是直接飼喂合適的dsRNA片段。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種基于細菌表達的dsRNA防治赤擬谷盜的方法；本發(fā)明旨在篩選并應用赤擬谷盜防治的dsRNA，為赤擬谷盜防治提供新的途徑。

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種dsRNA重組表達載體的構建方法，包括以下步驟：

1)、利用L4440質粒制備獲得L4440線性化載體；

2)、獲得赤擬谷盜的靶標基因；

3)、將L4440線性載體和赤擬谷盜靶標基因片段進行同源重組，將同源重組所得產(chǎn)物轉化到HT115(DE3)感受態(tài)細胞，得到表達赤擬谷盜靶標基因dsRNA的重組載體。

作為本發(fā)明的dsRNA重組表達載體的構建方法的改進：

當赤擬谷盜的靶標基因為TcCht10-1時，得到L4440-TcCht10-1重組質粒；

當赤擬谷盜的靶標基因為TcCht10-2時，得到L4440-TcCht10-2重組質粒；

當赤擬谷盜的靶標基因為TcPara-1時，得到L4440-TcPara-1重組質粒；

當赤擬谷盜的靶標基因為TcPara-2時，得到L4440-TcPara-2重組質粒；

當赤擬谷盜的靶標基因為TcSnf7時，得到L4440-TcSnf7重組質粒；