[發明專利]一種低氧誘導分泌乳酸氧化酶的大腸桿菌工程菌及其應用

在審

• 申請號: 202211616701.9
• 申請日: 2022-12-15
• 公開（公告）號: CN116254213A
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 傅譯可;李飛雨;李翔
• 申請（專利權）人: 浙江大學杭州國際科創中心
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/113;C12N15/70;A61K38/44;A61P35/00;A61P43/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種低氧誘導分泌乳酸氧化酶的大腸桿菌工程菌及其應用，涉及生物醫藥技術領域。本發明提供的工程化大腸桿菌能夠在體外及培養基條件下，遇到低氧環境時響應性合成乳酸氧化酶，乳酸氧化酶能夠分解局部的乳酸產生過氧化氫，進而起到對細胞、局部細菌的殺傷。這一過程在治療了局部病癥的同時，會使大腸桿菌載體隨著培養也被殺死，能夠降低本工程化大腸桿菌導致的外源感染風險，使工程化大腸桿菌整體表現為一種較安全的疾病治療菌種。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種低氧誘導分泌乳酸氧化酶的大腸桿菌工程菌及其應用。

背景技術

質粒(plasmid)是染色體外遺傳因子，能夠進行自主復制，不具有胞外期，非寄主細胞生長、代謝、繁殖等生命活動必須，但能賦予宿主細胞某些特殊屬性。質粒對大腸桿菌的轉化過程簡便，如電刺激、熱刺激、高濃度氯化鈣均能讓大腸桿菌轉化為感受態細胞，攝入質粒，并在正常條件下維持質粒穩定。同時，基于DNA內切酶的技術，質粒中的一些特殊序列很容易被DNA內切酶切開，隨后可以在其中插入特定的DNA序列，即實現對質粒的可控設計。該過程可使質粒具備合成諸多蛋白質的對應基因序列。在將其轉化入細菌后，即可令細菌生產特定的蛋白質。

啟動子是RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列，多數位于結構基因轉錄起始點的上游，啟動子本身不被轉錄。部分啟動子具有外場誘導性，在一些環境刺激下，會誘導進行轉錄功能，如自然界中存在一些熱誘導啟動子(例如Tcl)、輻射誘導啟動子(例如Egrl)。自然界中還存在一些乏氧啟動子，如PSnirB。PSnirB是一種來源于腸道沙門氏菌的厭氧誘導啟動子，在乏氧條件下，該啟動子的活性顯著提升。

乳酸氧化酶能夠氧化乳酸生成丙酮酸和過氧化氫，由于反應過程中不需要外源輔酶作為電子受體，具有較好的應用前景。然而，游離的乳酸氧化酶穩定性很差易失活，特別是如果在體液中，極易被血液中的蛋白酶水解失活。如何有效遞送乳酸氧化酶至作用部位，或在需要作用的部位響應性產乳酸氧化酶，在疾病治療領域一直是一項難點。

低氧氣濃度是許多疾病病灶區的特性，如腫瘤因快速生長代謝、壞疽因缺乏血供導致的低氧等。而低氧氣濃度給組織帶來的一大特性，即乳酸的積聚。

乳酸氧化酶催化乳酸產生的過氧化氫是一種常見的活性氧(ROS)，過氧化氫具有較高的氧化勢，對細胞、細菌均有一定殺傷作用。

將質粒轉化進大腸桿菌，構建乏氧響應性合成乳酸氧化酶的大腸桿菌，令其在乏氧環境原位合成乳酸氧化酶，催化局部乳酸生產過氧化氫，實現對細胞、細菌的殺傷，將會是種能有效利用乳酸氧化酶，擺脫其易失活特性的理想方式。

發明內容

有鑒于此，本申請目的是提供一種低氧誘導分泌乳酸氧化酶的大腸桿菌工程菌及其應用，同時提供一種能夠低氧響應性分泌乳酸氧化酶工程化大腸桿菌的制備方法，以及此工程化過程使用的質粒核苷酸序列。

具體得技術方案如下：

本發明提供了一種低氧誘導分泌乳酸氧化酶的大腸桿菌工程菌，以大腸桿菌作為出發菌，通過導入載有低氧誘導啟動子、分泌肽基因和乳酸氧化酶基因的質粒構建得到所述大腸桿菌工程菌。

所述低氧誘導啟動子為來源于豬霍亂沙門菌(Salmonella?Choleraesuis)C500的厭氧誘導啟動子PSnirB，來源于豬霍亂沙門菌C500的FNR啟動子家族，分泌肽基因為來源于果膠桿菌(Pectobacterium?carotovorum)的分泌肽基因pelB，是大腸桿菌中常見信號肽序列，乳酸氧化酶基因為來源于海豚鏈球菌(Streptococcus?iniae)的乳酸氧化酶基因lcto，乳酸氧化酶基因lcto序列并根據大腸桿菌密碼子偏好性優化，以提高其在大腸桿菌中的表達效率。

優選的，所述低氧誘導啟動子的序列如SEQ?ID?NO.1所示，分泌肽基因序列如SEQID?NO.3所示，乳酸氧化酶基因序列如SEQ?ID?NO.2所示。