[發(fā)明專利]一種等溫識(shí)別雙鏈DNA的核酸探針及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211615191.3
• 申請(qǐng)日: 2022-12-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115960998A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉國(guó)珍;余湉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 劉國(guó)珍;余湉
• 主分類號(hào): C12Q1/6844
• 分類號(hào): C12Q1/6844;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京鼎德寶專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11823
• 代理人: 姜愛(ài)君

本發(fā)明提供了一種等溫識(shí)別雙鏈DNA的核酸探針及其應(yīng)用。通過(guò)針對(duì)待測(cè)序列靶向設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)引物系列，在T4DNA連接酶擴(kuò)增耦合體系中實(shí)現(xiàn)高度同源序列的區(qū)分和前端放大，并與磁珠偶聯(lián)進(jìn)行提純，然后利用Exo?III核酸外切酶實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大和讀取。本發(fā)明所述技術(shù)方案的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1amol/L，特異性可以達(dá)到識(shí)別單個(gè)堿基的差異的核酸片段。不需要復(fù)雜昂貴的溫控設(shè)備就可實(shí)現(xiàn)待測(cè)物在同一管中同時(shí)指數(shù)擴(kuò)增和特異性高效甄別，高靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)區(qū)分高度同源的基因，快速得到檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明具有普適性，在單管實(shí)現(xiàn)高靈敏高特異性快速完全等溫操作適用于即時(shí)檢驗(yàn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及雙鏈DNA識(shí)別技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種等溫識(shí)別雙鏈DNA的核酸探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

截止2022年9月8日，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)生物公司基于猴痘核酸檢測(cè)的產(chǎn)品主要集中于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)相關(guān)試劑的研發(fā)和供給，極少數(shù)提供Bst?DNA聚合酶等常溫?cái)U(kuò)增酶類。

誠(chéng)然，實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(qPCR)一直是各種流行傳染病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其對(duì)儀器和溫度精準(zhǔn)控制的高度依賴性，極大限制了這種檢測(cè)方法廣泛使用。對(duì)于那些落后地區(qū)，特別是疾病發(fā)病率較高的地方-西非等地區(qū)，廣泛使用qPCR定性檢測(cè)病毒DNA變得不切實(shí)際。

另一方面，對(duì)于流行傳染病的溯源一直是疾病控制的一大難點(diǎn)，它涉及到對(duì)于高度同源序列的比對(duì)與區(qū)分。特別是猴痘，目前在2022年自然醫(yī)學(xué)期刊最新發(fā)表的一篇論文中對(duì)于2022年猴痘爆發(fā)進(jìn)行進(jìn)化枝和譜系分析，得出2022MPXV與相關(guān)2018-2019病毒的平均差異為50個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，比預(yù)期的要多?？紤]到先前對(duì)正痘病毒替代率的估計(jì)，這種不同的分支可能代表著病毒在加速進(jìn)化。這一研究無(wú)疑揭示了單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的對(duì)于研究猴痘病毒進(jìn)化和溯源的重要性，而這些在目前發(fā)表的期刊論文、已經(jīng)上市和即將上市的產(chǎn)品中都沒(méi)有任何體現(xiàn)。

因此，本申請(qǐng)將拓展核酸快速檢測(cè)方法，彌補(bǔ)當(dāng)前檢測(cè)不足，針對(duì)對(duì)多種高度同源序列的高特異性區(qū)分性差的問(wèn)題，擺脫對(duì)昂貴檢測(cè)儀器的依賴，實(shí)現(xiàn)等溫體外快速檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了解決傳統(tǒng)檢測(cè)各類流行性傳染疾病，如猴痘或者新冠等基因樣本對(duì)PCR儀器的高度依賴性以及簡(jiǎn)化流行性疾病溯源和進(jìn)化樹(shù)分析，解決檢測(cè)過(guò)程中突變頻率手續(xù)復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)成本高的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于快速實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增并且實(shí)現(xiàn)高靈敏高特異性檢測(cè)各類高度同源序列的多重檢測(cè)，可以快速判讀樣本中DNA是否是目標(biāo)基因，并且區(qū)分高度同源序列，為醫(yī)生的診斷提供準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)，降低了檢測(cè)時(shí)間和成本，提出一種等溫識(shí)別雙鏈DNA的核酸探針及其應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種等溫識(shí)別雙鏈DNA的核酸探針，包括：

檢測(cè)體系：所述檢測(cè)引物包括檢測(cè)引物和檢測(cè)試劑；所述檢測(cè)引物為待測(cè)序列前段引物(Fw探針)、待測(cè)序列純化引物(BP探針)和待測(cè)序列后端放大引物(AP探針)，所述檢測(cè)試劑包括T4?DNA連接酶、MgOAC、緩沖液和RPA干粉；

純化磁珠：所述純化磁珠為鏈霉親和素磁珠；

二次放大體系：所述二次放大體系包括ExoIII核酸外切酶和待測(cè)序列的熒光報(bào)告探針。

在一些實(shí)施方案中，所述前段引物的堿基長(zhǎng)度為18～24個(gè)，包括40～60％的G/C含量，熔化溫度50～60℃；

在一些實(shí)施方案中，所述純化引物位于后端放大引物上游，與后端放大引物頭尾相連無(wú)任何間隔，所述純化引物5端序列修飾磷酸基團(tuán)，3端序列修飾生物素且與待測(cè)序列模板互補(bǔ)配對(duì)；純化引物堿基長(zhǎng)度為18～24個(gè)，包括40～60％的G/C含量，熔化溫度50～60℃；