[發明專利]一種等溫識別雙鏈DNA的核酸探針及其應用

在審

• 申請號: 202211615191.3
• 申請日: 2022-12-15
• 公開（公告）號: CN115960998A
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 劉國珍;余湉
• 申請（專利權）人: 劉國珍;余湉
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京鼎德寶專利代理事務所(特殊普通合伙) 11823
• 代理人: 姜愛君

1.一種等溫識別雙鏈DNA的核酸探針，其特征在于，包括：

檢測體系：所述檢測體系包括檢測引物和檢測試劑；所述檢測引物為待測序列前端引物、待測序列純化引物和待測序列后端放大引物，所述檢測試劑包括T4?DNA連接酶、MgOAC、緩沖液和RPA干粉；

純化磁珠：所述純化磁珠為鏈霉親和素磁珠；

二次放大體系：所述二次放大體系包括ExoIII核酸外切酶和待測序列的熒光報告探針。

2.根據權利要求1所述等溫識別雙鏈DNA的核酸探針，其特征在于，

所述前端引物堿基長度為18～24個，包括40～60％的G/C含量，熔化溫度50～60℃；

所述純化引物位于后端放大引物上游，與后端放大引物頭尾相連無任何間隔，所述純化引物5端序列修飾磷酸基團，3端序列修飾生物素且與待測序列模板互補配對；純化引物堿基長度為18～24個，包括40～60％的G/C含量，熔化溫度50～60℃；

所述后端放大引物具有一段互補配對片段和一段非互補配對片段；所述互補配對片段對與待測序列檢測位點互補配對，堿基長度為18～24個，包括40～60％的G/C含量，熔化溫度50～60℃；所述非互補配對片段，無任何GC序列；長度為18～27個堿基長度；

所述熒光報告探針與后端放大引物互補配對，長度為18nt；3端為熒光基團，間隔三或四個堿基后是猝滅基團。

3.權利要求1～2任意一項所述等溫識別雙鏈DNA的核酸探針的應用，其特征在于，包括如下步驟：

1)根據待測基因設計前端引物，純化引物，后端放大引物和熒光報告探針；

2)將待測基因配置成待測溶液，取待測溶液、待測序列前段引物、待測序列純化引物和待測序列后端放大引物、T4?DNA連接酶、MgOAC、緩沖液和RPA干粉混合均勻，進行擴增反應；

3)擴增反應結束后，將反應產物與鏈霉親和素磁珠混合進行孵育，孵育結束后用孵育緩沖液清洗磁珠進行純化；

4)取出鏈霉親和素磁珠，直接向鏈霉親和素磁珠中加入ExoIII核酸外切酶和熒光報告探針進行二次放大反應，置于酶標儀下獲取熒光讀數。

4.根據權利要求3所述等溫識別雙鏈DNA的核酸探針的應用，其特征在于，所述待測溶液濃度為1aM～10nM；優選地，所述待測溶液濃度為100aM～1pM。

5.根據權利要求3所述等溫識別雙鏈DNA的核酸探針的應用，其特征在于，所述待測溶液、前段引物、純化引物、后端放大引物的濃度比為1～2：1～2：1～2：1.25～2；T4DNA連接酶終濃度：10～20U。

6.根據權利要求3所述等溫識別雙鏈DNA的核酸探針的應用，其特征在于，所述鏈霉親和素磁珠直徑為1～10μm，修飾有鏈霉親和素。

7.根據權利要求3所述等溫識別雙鏈DNA的核酸探針的應用，其特征在于，所述孵育緩沖液包括1xPBST孵育緩沖液和1xPBS孵育緩沖液；所述1xPBST孵育緩沖液包括，137mMNaCl，2.7mM?KCl，4.3mM?Na₂HPO₄，1.47mM?KH₂PO₄和0.05％v/v(體積比)Tween-20，pH為7.4；所述1xPBS孵育緩沖液包括，137mM?NaCl，2.7mM?KCl，4.3mM?Na₂HPO₄和1.47mM?KH₂PO₄，pH為7.4。

8.根據權利要求3所述等溫識別雙鏈DNA的核酸探針的應用，其特征在于，所述ExoIII核酸外切酶終濃度為10～20U；熒光報告探針終濃度為400～600nM。

9.根據權利要求3所述等溫識別雙鏈DNA的核酸探針的應用，其特征在于，所述擴增反應的反應溫度為35～38℃，反應時間為30～60min；所述二次放大反應的反應溫度為36～39℃，反應時間20～40min。

10.根據權利要求3所述等溫識別雙鏈DNA的核酸探針的應用，其特征在于，根據熒光報告探針中熒光基團的激發波長和發射波長進行熒光讀數，以識別待測序列。