[發(fā)明專利]結(jié)直腸癌SDC2甲基化檢測(cè)引物、探針、試劑盒及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211609009.3
• 申請(qǐng)日: 2022-12-14
• 公開（公告）號(hào): CN116254338A
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建省腫瘤醫(yī)院（福建省腫瘤研究所;福建省癌癥防治中心）
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 福州市博深專利事務(wù)所(普通合伙) 35214
• 代理人: 謝子能

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及結(jié)直腸癌SDC2甲基化檢測(cè)引物、探針、試劑盒及方法。本發(fā)明的引物為SDC2cgA引物和/或SDC2cgB引物，探針為SDC2cgA探針和/或SDC2cgB探針。本發(fā)明使用單一位點(diǎn)cgA或cgB進(jìn)行甲基化檢測(cè)，能有效地避開高GC位點(diǎn)的擴(kuò)增，避開PCR反應(yīng)失敗等擴(kuò)增問題，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性好，成本低的特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及結(jié)直腸癌SDC2甲基化檢測(cè)引物、探針、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

近幾年來，隨著人們生活水平提高以及膳食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率已躍居惡性腫瘤的前五位，尤其在城市的發(fā)病率位居惡性腫瘤第二位，死亡率第四位。結(jié)直腸癌的早期診斷和治療對(duì)于患者的預(yù)后和生存起著關(guān)鍵性的作用。得益于基因診斷技術(shù)的發(fā)展，我國(guó)結(jié)直腸癌的5年存活率不斷地提高達(dá)到了57.6％左右，但仍低于歐洲和美國(guó)水平(分別為60％和64％)。

目前，醫(yī)院檢測(cè)結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)方法為乙狀結(jié)腸鏡檢查，但其檢測(cè)費(fèi)用高，檢測(cè)過程對(duì)患者傷害大。而市面上出現(xiàn)的許多甲基化分子診斷試劑盒可以克服以上鏡檢缺點(diǎn)作為早期輔助診斷有效手段。研究證實(shí)結(jié)直腸癌相關(guān)基因SDC2高度甲基化伴隨著或早于細(xì)胞惡性增生，可以作為非常有效的癌癥DNA甲基化標(biāo)記物，其基因的甲基化的檢測(cè)可用于結(jié)直腸癌的預(yù)測(cè)。

甲基化檢測(cè)過程一般為以重亞硫酸鹽處理后DNA片段作為模板，特異地設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于擴(kuò)增含待測(cè)甲基化位點(diǎn)的小片段DNA，同時(shí)用一個(gè)與待測(cè)甲基化位點(diǎn)雜交互補(bǔ)的探針，由于探針5'端含有報(bào)告熒光，通過熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。目前的結(jié)直腸癌甲基化檢測(cè)試劑盒大都是采用熒光法作為檢測(cè)技術(shù)，熒光法基于Taqman熒光定量PCR技術(shù)，是目前最為常見而且最有效率檢測(cè)基因甲基化的分子診斷手段之一。

SDC2甲基化檢測(cè)位點(diǎn)大多數(shù)都集中在啟動(dòng)子CpG島多個(gè)位點(diǎn)：公布號(hào)為CN102686744?A的中國(guó)發(fā)明專利的檢測(cè)位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)+681到+1800核苷酸之間；公布號(hào)為CN?105543354?A的中國(guó)發(fā)明專利的檢測(cè)位點(diǎn)位于起始位點(diǎn)+350到+382核酸之間；公布號(hào)為CN?109486955?A的中國(guó)發(fā)明專利的檢測(cè)位點(diǎn)位于+250到+800核酸之間。轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)+250到+800核酸區(qū)間因含有大量的CpG島，為SDC2甲基化檢測(cè)的熱點(diǎn)區(qū)域。由這些檢測(cè)區(qū)域開發(fā)的結(jié)直腸癌的試劑盒都能有效地檢測(cè)出陽性樣本，其敏感度一般在85％～90％之間。

SDC2多位點(diǎn)檢測(cè)方法比較復(fù)雜且篩選成本高，引物探針需要嚴(yán)格設(shè)計(jì)來避免非特異性擴(kuò)增以及克服高GC?PCR擴(kuò)增條件。SDC2多位點(diǎn)檢測(cè)區(qū)域大多數(shù)都位于幾個(gè)GC位點(diǎn)上，多GC位點(diǎn)擴(kuò)增往往容易導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗，其原因?yàn)椋?/p>

一、GC含有的氫鍵比例比AT多，PCR擴(kuò)增過程中需要更多的能量去解開模板DNA雙鏈，模板DNA不容易解開會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降；

二、經(jīng)亞硫酸處理后的雙鏈DNA變成了單鏈，單鏈DNA中GC豐富區(qū)域往往容易通過自身互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的發(fā)夾環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致PCR引物和探針無法結(jié)合到模板上，DNA聚合酶延伸也受到阻礙，結(jié)果常出現(xiàn)嚴(yán)重的非特異性條帶，甚至擴(kuò)增不出靶基因。

目前SDC2甲基化檢測(cè)試劑盒一般都采用多位點(diǎn)檢測(cè)，有的采用聯(lián)合多個(gè)基因多個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)來提高其敏感度，有的使用二代測(cè)序，檢測(cè)幾百上千個(gè)甲基化位點(diǎn)來媲美乙狀結(jié)腸鏡檢查敏感度，由此開發(fā)的試劑盒往往成本高，不適用于大批量的篩查。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供結(jié)直腸癌SDC2甲基化檢測(cè)引物、探針、試劑盒及方法，該方法具有較高的靈敏度和特異性，該方法以非診斷為目的。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種結(jié)直腸癌SDC2甲基化檢測(cè)的引物和探針，引物為SDC2?cgA引物和/或SDC2?cgB引物，探針為SDC2?cgA探針和/或SDC2?cgB探針；cgA為cg16935295；cgB為cg13096260；