[發(fā)明專利]一種鴨坦布蘇病毒病、鴨病毒性肝炎病毒二聯(lián)三價(jià)卵黃抗體的制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211605428.X
• 申請(qǐng)日: 2022-12-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116375850A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李娥;崔松奇;張文芳;饒瀟君;余海濤;劉興剛;張良;柴沛瑤;李曉靜;崔學(xué)毅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 豪威生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/10
• 分類號(hào): C07K16/10;C07K16/02;C12N7/00;C12N7/04;A61K39/395;A61P31/14;A61P1/16;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 天津兆謙源專利代理事務(wù)所(普通合伙) 12265
• 代理人: 許黛君

1.一種鴨坦布蘇病毒病、鴨病毒性肝炎病毒二聯(lián)三價(jià)卵黃抗體的制備方法，其特征是：包括以下步驟，

步驟一，制備鴨坦布蘇病毒抗原液；

S1、蚊源C6/36細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)；

使用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)蚊源C6/36細(xì)胞，培養(yǎng)基選取為蚊源細(xì)胞用培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度27℃及5％濃度CO₂，每3天進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞密度為3～5×10⁶cells/ml；

S2、病毒液的制備；

將實(shí)驗(yàn)室分離得到的鴨坦布蘇病毒按照0.05％的劑量同步接種于1.5～4×10⁵cells/ml的細(xì)胞懸液中，在溫度27℃及5％濃度的CO₂的條件下貼壁生長(zhǎng)96～144小時(shí)，根據(jù)細(xì)胞病變程度收獲細(xì)胞病毒液；

S3、收獲抗原液；

將細(xì)胞病毒液置于-20℃的溫度條件下凍存一次，取出融化后于冷藏條件下、在3000rpm條件下離心15分鐘，收集上清液后，使用30KD膜包進(jìn)行5～10倍濃縮，使雞胚效力檢測(cè)控制在10^6.0～10^6.5ELD₅₀/0.1ml；

S4、對(duì)鴨坦布蘇病毒抗原液進(jìn)行滅活并保存；

將檢驗(yàn)合格的抗原液置于滅菌容器內(nèi)，以終濃度1‰的比例加入甲醛，在37℃的溫度條件下滅活24小時(shí)，滅活后置于2～8℃的溫度條件下保存；

S5、對(duì)鴨坦布蘇病毒抗原液進(jìn)行凍干并保存；

將收獲的抗原液與1％SPGA溶液等比例混合后分裝，每瓶2ml，凍干結(jié)束后置于-20℃的溫度條件下行保存；

步驟二，制備I型鴨肝炎病毒抗原液；

S1、接種Ⅰ型鴨肝炎病毒；

將實(shí)驗(yàn)室分離篩選得到的免疫原性良好的Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒經(jīng)SPF雞胚多次傳代后，獲得的一株穩(wěn)定的、免疫原性好的雞胚適應(yīng)疫苗制備毒株，于尿囊腔接種9～10日齡的SPF雞胚，接種量為0.1ml/枚，棄去48小時(shí)以內(nèi)死亡的雞胚，觀察48～120小時(shí)，收獲尿囊液；

S2、收獲Ⅰ型鴨肝炎病毒抗原液；

將48～120小時(shí)死亡的雞胚放于冷藏室，消毒后收獲尿囊液，在3000rpm的條件下離心20分鐘后，使用截留量為30KD的膜包進(jìn)行過(guò)濾；

S3、對(duì)Ⅰ型鴨肝炎病毒抗原液進(jìn)行滅活并保存；

將檢驗(yàn)合格的抗原液置于滅菌容器內(nèi)，以終濃度1‰的比例加入甲醛，在37℃的溫度條件下滅活24小時(shí)，滅活后置于2～8℃的溫度條件下保存；

步驟三，制備Ⅲ型鴨肝炎病毒抗原液；

S1、接種Ⅲ型鴨肝炎病毒；

將實(shí)驗(yàn)室分離得到的免疫原性良好的Ⅲ型鴨病毒性肝炎病毒尿囊腔接種11～12日齡的SPF鴨胚，接種量為0.1ml/枚，棄去48小時(shí)以內(nèi)死亡的鴨胚，觀察48～120小時(shí)，收獲尿囊液；

S2、收獲Ⅲ型鴨肝炎病毒抗原液；

將48～120小時(shí)死亡的鴨胚放于冷藏室，消毒后收獲尿囊液，在3000rpm的條件下離心20分鐘后，使用截留量為30KD的膜包進(jìn)行過(guò)濾；

S3、對(duì)Ⅲ型鴨肝炎病毒抗原液進(jìn)行滅活并保存；

將檢驗(yàn)合格的抗原液置于滅菌容器內(nèi)，以終濃度1‰的比例加入甲醛，在37℃的溫度條件下滅活24小時(shí)，滅活后置于2～8℃的溫度條件下保存；

步驟四，制備疫苗；

S1、油相制備；

取白油95份，加入1份硬脂酸鋁，混合均勻并加熱至80℃后，再加入5份司本80，完全溶解后，在121℃的溫度條件下維持30分鐘；

S2、水相制備；

取效價(jià)符合要求的滅活抗原液，按照鴨坦布蘇病毒抗原液：I型鴨肝炎病毒抗原液：Ⅲ型鴨肝炎病毒抗原液為1～3:1～3:2～5的比例關(guān)系進(jìn)行配比并充分混勻；

S3、制備疫苗；

取2份油相置于乳化罐中，緩慢加入1份水相，再以8000rpm的條件乳化10分鐘，乳化后取10ml，以3000rpm的條件離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不超過(guò)0.5ml，定量分裝并加蓋密封，置于2～8℃的溫度條件下保存；

步驟五，建立雞場(chǎng)蛋雞免疫程序；

S1、免疫雞只；

選擇100日齡的產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，首次免疫：將鴨坦布蘇病毒病凍干苗肌肉注射健康產(chǎn)蛋雞，每只注射量為0.5ml；二次免疫：首次免疫二周后用二聯(lián)三價(jià)滅活疫苗頸部皮下注射健康產(chǎn)蛋雞，每只注射量為2.0ml；三次免疫：二次免疫三周后，胸部肌肉多點(diǎn)注射二聯(lián)三價(jià)滅活疫苗，每只注射量為2.0ml；四次免疫：三次免疫三周后，腿部皮下注射二聯(lián)三價(jià)滅活疫苗，每只注射量為1.0ml；維持免疫：根據(jù)抗體效價(jià)，隔2～3個(gè)月后再加強(qiáng)接種1次，每只注射量為2.0ml；

S2、收集高免蛋；

產(chǎn)蛋期四次強(qiáng)化免疫接種結(jié)束7～14日后，每隔7日抽樣高免蛋測(cè)定三種病毒的中和抗體效價(jià)，待鴨病毒性肝炎抗體中和效價(jià)測(cè)定均≥1:1024，鴨坦布蘇病毒病抗體中和效價(jià)≥1:128后，即可收集高免蛋；

步驟六，制備高免蛋卵黃抗體；

高免蛋消毒后，分離卵黃系膜，收集蛋黃；配制酸化緩沖液，pH調(diào)至4.5～5.5之間；依據(jù)高免蛋的中和抗體效價(jià)結(jié)果，將蛋黃與酸化緩沖液按照1:4～1:8進(jìn)行混合攪拌，室溫靜置5～12小時(shí)；取上清液進(jìn)行過(guò)濾，添加0.8％的正辛酸并混勻攪拌，室溫靜置3～7小時(shí)；取清亮液連續(xù)用1.0μm和0.45μm的濾芯進(jìn)行過(guò)濾；使用截留分子量為100KD的膜包將上述過(guò)濾液濃縮5～10倍；按照終濃度1‰的甲醛濃度進(jìn)行滅活，室溫滅活24小時(shí)；依據(jù)抗體中和效價(jià)的結(jié)果，對(duì)濃縮液進(jìn)行稀釋得到鴨坦布蘇病毒、鴨病毒性肝炎病毒二聯(lián)三價(jià)卵黃抗體。