[發明專利]能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法

在審

• 申請號: 202211592230.2
• 申請日: 2022-12-12
• 公開（公告）號: CN116024298A
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 周元元;鄒勇平;李奇;王帥;胡云;楊嘉;盧偉;何旭東
• 申請（專利權）人: 揚州市食品藥品檢驗檢測中心
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12Q1/04;C12R1/225
• 代理公司: 合肥數字代碼知識產權代理有限公司 34253
• 代理人: 何雪峰

本發明涉及乳酸桿菌活菌計數技術領域，具體地說，涉及能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法。其包括以下步驟：選擇培養基和染色液；菌種活化、培養與稀釋；對乳酸桿菌進行有效活菌染色判定，采用FDA染色與革蘭氏染色雙染法對乳酸桿菌進行染色，判定菌體的活性和菌種；雙染后的乳酸桿菌采用平板計數法進行活菌計數；設備清洗。采用FDA染色與革蘭氏染色雙染法實現對乳酸桿菌的活菌進行計數，通過對乳酸桿菌數中的死亡菌體DNA進行屏蔽，通過對活菌進行染色分辨，可提高乳酸桿菌計數的有效精度。

技術領域

本發明涉及乳酸桿菌活菌計數技術領域，具體地說，涉及能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法。

背景技術

乳酸桿菌在維護人和高等動物機體健康方面具有重要的作用。在營養生理方面，乳酸桿菌可提高蛋白質、乳糖和鈣等營養物質的消化吸收，可產生多種維生素為機體消化吸收所利用；可抑制腸道內腐敗菌、致病菌的繁殖，降低血氨和血中膽固醇的含量，并具有維持腸道內菌群平衡的整腸作用。

乳酸桿菌在食品、飲料、飼料和醫藥等多個領域獲得廣泛的應用，而評價乳酸桿菌產品品質的指標之一就是產品中的活菌數，平板菌落計數法是常用的微生物計數方法，現有復合菌中乳酸菌的分離計數多采用MRS培養基，但有的乳酸桿菌存在自然衰亡的現象，在傳統平板菌落計數法中，由于試驗環境等因素影響，乳酸桿菌會迅速繁殖和死亡，死亡的乳酸桿菌其營養價值也會降低，乳酸桿菌的部分死亡會干擾乳酸桿菌的有效計數，因此需要能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法，來準確測定乳酸桿菌中的活菌數量。

發明內容

本發明的目的在于提供能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法，包括以下步驟：

S1：選擇培養基和染色液；

S2：菌種活化、培養與稀釋；

S3：對乳酸桿菌進行有效活菌染色判定，采用FDA染色與革蘭氏染色雙染法對乳酸桿菌進行染色，判定菌體的活性和菌種；

S4：雙染后的乳酸桿菌采用平板計數法進行活菌計數；

S5：設備清洗。

作為本技術方案的進一步改進，所述S1中，所述培養基為MRS培養基、TJA培養基和ATP培養基中的任意一種，所述染色液包括用于測定細胞活性的FDA染色液和用于區分乳酸桿菌的革蘭氏染色液。

作為本技術方案的進一步改進，所述S2中，所述乳酸桿菌通過培養基在37℃溫度環境下活化，使菌體液活力達10⁷

CFU/mL；并制成多組不同的10倍遞增稀釋液(使用滅菌生理鹽水進行稀釋)，從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與培養基混合、培養。

作為本技術方案的進一步改進，制備10倍遞增稀釋液時，在超凈工作臺內用滅菌的1.5ml離心管，按10倍比稀釋法稀釋，用移液器吸取上述混懸液100ul，注入含有900ul緩沖液的離心管內，并在液體中反復吹打5次，在漩渦振蕩器上震蕩30s混勻。

作為本技術方案的進一步改進，所述S3中，FDA染色與革蘭氏染色雙染法具體染色步驟為：

S3.1：取干凈載玻片，取出培養的稀釋液，使用FDA染色液對其進行初染，在室溫黑暗處靜置5min染色，判定并檢測細胞活性；

S3.2：靜置后的稀釋液，使用革蘭氏染色液進行復染；來判斷、區分乳酸桿菌；

S3.3：將染色后的稀釋液進行鏡檢、計數。

作為本技術方案的進一步改進，所述S4中，所述平板計數法具體試驗步驟為：