[發明專利]能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法在審
| 申請號： | 202211592230.2 | 申請日： | 2022-12-12 |
| 公開（公告）號： | CN116024298A | 公開（公告）日： | 2023-04-28 |
| 發明（設計）人： | 周元元;鄒勇平;李奇;王帥;胡云;楊嘉;盧偉;何旭東 | 申請（專利權）人： | 揚州市食品藥品檢驗檢測中心 |
| 主分類號： | C12Q1/06 | 分類號： | C12Q1/06;C12Q1/04;C12R1/225 |
| 代理公司： | 合肥數字代碼知識產權代理有限公司 34253 | 代理人： | 何雪峰 |
| 地址： | 225000 江蘇*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 能夠 屏蔽 死亡 菌體 dna 乳酸 桿菌 計數 方法 | ||
1.能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1：選擇培養基和染色液；
S2：菌種活化、培養與稀釋；
S3：對乳酸桿菌進行有效活菌染色判定，采用FDA染色與革蘭氏染色雙染法對乳酸桿菌進行染色，判定菌體的活性和菌種；
S4：雙染后的乳酸桿菌采用平板計數法進行活菌計數；
S5：設備清洗。
2.根據權利要求1所述的能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法，其特征在于：所述S1中，所述培養基為MRS培養基、TJA培養基和ATP培養基中的任意一種，所述染色液包括用于測定細胞活性的FDA染色液和用于區分乳酸桿菌的革蘭氏染色液。
3.根據權利要求1所述的能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法，其特征在于：所述S2中，所述乳酸桿菌通過培養基在37℃溫度環境下活化，使菌體液活力達107CFU/mL；制成多組不同的10倍遞增稀釋液，從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與培養基混合、培養。
4.根據權利要求3所述的能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法，其特征在于：制備10倍遞增稀釋液時，在超凈工作臺內用滅菌的1.5ml離心管，按10倍比稀釋法稀釋，用移液器吸取上述混懸液100ul，注入含有900ul緩沖液的離心管內，并在液體中反復吹打5次，在漩渦振蕩器上震蕩30s混勻。
5.根據權利要求1所述的能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法，其特征在于：所述S3中，FDA染色與革蘭氏染色雙染法具體染色步驟為：
S3.1：取干凈載玻片，取出培養的稀釋液，使用FDA染色液對其進行初染，在室溫黑暗處靜置5min染色；
S3.2：靜置后的稀釋液，使用革蘭氏染色液進行復染；
S3.3：將染色后的稀釋液進行鏡檢、計數。
6.根據權利要求1所述的能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法，其特征在于：所述S4中，所述平板計數法具體試驗步驟為：
S4.1：選擇多個稀釋度，每個稀釋度取1ml菌液，加9ml生理鹽水混勻；
S4.2：在混勻后的菌液中再取1ml菌液，加9ml生理鹽水進行二次稀釋；
S4.3：將二次稀釋后的菌液滴取置于載玻片上，在顯微鏡下觀察；
S4.4：觀察并記下平板的菌落總數后，計算出原始樣品中的菌落數，求出平均菌落數，其中，菌落數計算公式如下：
式中：N為樣品中菌落數；∑C為平板菌落數之和；n1為第一稀釋度平板個數；n2為第二稀釋度平板個數；d為稀釋因子(第一稀釋度)；
S4.5：在顯微鏡下觀察，載玻片面積1cm2，每次平均觀察20-
30個視野后代入計數公式，對菌液中活菌數進行計算(已通過雙染法對乳酸桿菌的活菌進行區分)，計算公式為：
7.根據權利要求6所述的能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法，其特征在于：所述S4.3中，滴取置于載玻片上的菌液為10ul，菌液滴取至滅菌平皿上，每個稀釋度做3個平行，計算平皿同一稀釋度3個平行組的菌落平均數。
8.根據權利要求6所述的能夠屏蔽死亡菌體DNA的乳酸桿菌的活菌計數方法，其特征在于：所述S4.3中，在載玻片中加入0.001％一氯化三苯基四氮唑(TTC)，防止菌落蔓延。
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