[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)甲羥戊酸的重組鹽單胞菌及構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211581639.4
• 申請(qǐng)日: 2022-12-09
• 公開（公告）號(hào): CN115820527A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳濤;張靜;元躍;王智文;陳國(guó)強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué);清華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12P7/42;C12R1/01
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種生產(chǎn)甲羥戊酸的重組鹽單胞菌的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟：

1)敲除鹽單胞菌Halomonas sp.TD01中3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶編碼基因phaB和PHA合成酶編碼基因phaC；

2)將乳桿菌來源的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶編碼基因mvaE_lac和3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶編碼基因mvaS_lac表達(dá)單元靶向整合至步驟1)所得菌株基因組G7位點(diǎn)；得到在G7位點(diǎn)整合有mvaE_lac和mvaS_lac表達(dá)單元的重組菌株Halomonas sp.

TDMVA-01；

3)將糞腸球菌來源的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶編碼基因mvaE_ef和3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶編碼基因mvaS_ef表達(dá)單元靶向整合至步驟2)所得菌株基因組G4位點(diǎn)，得到生產(chǎn)甲羥戊酸的重組鹽單胞菌；

所述基因phaB的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述基因phaC的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述基因mvaE_lac和mvaS_lac表達(dá)單元的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述基因組G7位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述基因mvaE_ef和mvaS_ef表達(dá)單元的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述基因組G4位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

2.權(quán)利要求1的方法構(gòu)建的生產(chǎn)甲羥戊酸的重組鹽單胞菌。

3.權(quán)利要求2的生產(chǎn)甲羥戊酸的重組鹽單胞菌在發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸中的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟：

(1)活化菌株：將權(quán)利要求2的生產(chǎn)甲羥戊酸的重組鹽單胞菌在60LB固體培養(yǎng)基中劃線，35-37℃培養(yǎng)8-16h，得到活化菌株；

(2)種子液的制備：將步驟(1)獲得的活化菌株接種到60LB液體培養(yǎng)基中，35-37℃，180-240rpm培養(yǎng)8-16h，將所得菌液按照體積比為1％-2％的接種量接種到新制備的60LB液體培養(yǎng)基中，35-37℃，180-240rpm培養(yǎng)8-20h，獲得種子液；

(3)搖瓶發(fā)酵：將步驟(2)獲得的種子液按照體積比為1％-5％的比例接種到裝有20-100mL的發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，32-37℃，180-240rpm培養(yǎng)48-80h，得到含有甲羥戊酸的發(fā)酵液。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟：

(1)活化菌株：將權(quán)利要求2的生產(chǎn)甲羥戊酸的重組鹽單胞菌在60LB固體培養(yǎng)基中劃線，35-37℃培養(yǎng)8-16h，得到活化菌株；

(2)種子液的制備：將步驟(1)獲得的活化菌株接種到60LB液體培養(yǎng)基中，35-37℃，180-240rpm培養(yǎng)8-16h，將所得菌液按照體積比為1％的接種量接種到新制備的60LB液體培養(yǎng)基中，35-37℃，180-240rpm培養(yǎng)8-20h，獲得種子液；

(3)發(fā)酵罐發(fā)酵：將步驟(2)獲得的種子液按照體積比為1％-10％的比例接種到裝有2-3L的第二種發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，pH始終維持7-12，在32-37℃，攪拌轉(zhuǎn)速300-800rpm的條件下發(fā)酵，溶氧關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)速控制在10％-30％，在開始發(fā)酵的8小時(shí)至22小時(shí)內(nèi)補(bǔ)加氮源，補(bǔ)加的氮源與第二種發(fā)酵培養(yǎng)基的比為1g/L；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源濃度降到1-5g/L時(shí)，采用連續(xù)流加或間歇流加的方式補(bǔ)充補(bǔ)料培養(yǎng)基，維持碳源濃度在10-80g/L，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液中的甲羥戊酸濃度停止增加時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，得到含有甲羥戊酸的發(fā)酵液。