[發明專利]一種生產甲羥戊酸的重組鹽單胞菌及構建方法與應用

在審

• 申請號: 202211581639.4
• 申請日: 2022-12-09
• 公開（公告）號: CN115820527A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 陳濤;張靜;元躍;王智文;陳國強
• 申請（專利權）人: 天津大學;清華大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12P7/42;C12R1/01
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

本發明公開了一種生產甲羥戊酸的重組鹽單胞菌及構建方法與應用，其構建方法為：1)敲除鹽單胞菌Halomonas sp.TD01中基因phaB和基因phaC；2)將基因mvaE_lac和基因mvaS_lac表達單元靶向整合至步驟1)所得菌株基因組G7位點；得到在G7位點整合有mvaE_lac和mvaS_lac表達單元的重組菌株；3)將基因mvaE_ef和mvaS_ef表達單元靶向整合至步驟2)所得菌株基因組G4位點，得到生產甲羥戊酸的重組鹽單胞菌；本發明構建的重組菌，有效利用不同碳源發酵生產甲羥戊酸，其甲羥戊酸產量和底物轉化率高，穩定性好，無需誘導劑和抗生素。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地涉及一種生產甲羥戊酸的重組鹽單胞菌株及構建方法與應用。

背景技術

甲羥戊酸(mevalonic acid，MVA)又名甲瓦龍酸，分子式為C₆H₁₂O₄，最初作為乳酸菌的乙酸替代生長因子在酒精發酵廢液中被發現，后又在火落菌發酵的日本清酒中被發現。甲羥戊酸呈油狀，易溶于水和極性有機溶液，在酸性條件下易內酯化形成甲羥戊酸內酯C₆H₁₀O₃(mevalonlactone，MVAL)。甲羥戊酸是甲羥戊酸途徑(MVApathway)的重要中間體，參與合成類固醇和萜烯，包括異戊二烯、蒎烯、類胡蘿卜素、青蒿素和紫杉醇等。目前甲羥戊酸在生產抗瘧疾藥物青蒿素、抗癌化合物中間體紫杉醇、橡膠前體異戊二烯以及生物燃料3-甲基-3-丁烯-1-醇等領域已經有相關應用報道，具有廣闊的應用前景。

甲羥戊酸普遍存在于大多數真核生物、病毒和高等植物中，其生物合成過程為，以三分子乙酰輔酶A為前體，經三步酶反應，消耗兩分子還原力NADPH或NADH合成一分子甲羥戊酸。具體為首先乙酰輔酶A乙酰轉移酶將兩分子乙酰CoA縮合成乙酰乙酰CoA，進一步在3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶作用下引入第三個乙酰CoA分子縮合生成3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)，最后HMG-CoA被3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶還原為甲羥戊酸。甲羥戊酸可進一步生成異戊二烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，用于合成下游的萜類和類固醇化合物。除生物合成法外，甲羥戊酸也可通過化學法合成，但由于生物合成法具有可持續性和綠色環保等優勢，近年來利用多種微生物，如大腸桿菌(Escherichia coli)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等，通過代謝工程手段改造合成甲羥戊酸的研究越來越多。

鹽單胞菌TD01(Halomonas sp.TD01)是一株中度嗜鹽嗜堿微生物，具有耐高鹽(NaCl，50～60g/L)、高堿(pH，9～11)、魯棒性強、底物利用譜廣和耐受高濃度有機酸鹽等特點。這些獨特的生理特征賦予了鹽單胞菌可在開放式、不滅菌條件下連續發酵培養，相比于普通模式微生物，以鹽單胞菌為底盤細胞在工業應用上更能節約原料、設備和人工的投資成本，簡化發酵工藝，具有更高的經濟性和價值性。近年來針對鹽單胞菌的相關分子生物學方法和基因操作技術都已建立，有利于通過代謝工程及合成生物學的合理設計進行菌株改造。目前鹽單胞菌已成為“下一代工業生物技術”的明星底盤，被廣泛地改造用于生產各類高附加值產品，包括聚羥基脂肪酸酯、蛋白質、5-氨基乙酰丙酸、L-蘇氨酸、四氫嘧啶、3-羥基丙酸、衣康酸等。

經檢索，目前未見有在基因組上改造鹽單胞菌Halomonas sp.TD01用于生產甲羥戊酸的相關報道。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種生產甲羥戊酸的重組鹽單胞菌。

本發明的第二個目的是提供一種生產甲羥戊酸的重組鹽單胞菌的構建方法。

本發明的第三個目的是提供生產甲羥戊酸的重組鹽單胞菌在發酵生產甲羥戊酸的應用。