[發(fā)明專(zhuān)利]一種快速檢測(cè)鱘魚(yú)感染海分枝桿菌的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211580227.9
• 申請(qǐng)日: 2022-12-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115951052A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許巧情;謝夢(mèng);余婷;李騫;郭慧芝;周江;羅凱
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 長(zhǎng)江大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/569
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/569;G01N33/68
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 黃明光

本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)鱘魚(yú)感染海分枝桿菌的方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明分別以海分枝桿菌的Ag85B和Rpf毒力蛋白作為刺激鱘魚(yú)T細(xì)胞的海分枝桿菌特異性抗原；以商業(yè)化的兔源IFN?γ多抗作為捕獲抗體，再以制備的鼠源IFN?γ多抗作為檢測(cè)抗體，利用間接夾心ELISA檢測(cè)IFN?γ的分泌來(lái)判斷鱘魚(yú)是否感染了海分枝桿菌。本發(fā)明檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易操作，適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展，檢測(cè)方法靈敏度和準(zhǔn)確度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)鱘魚(yú)感染海分枝桿菌染的方法。

背景技術(shù)

鱘魚(yú)隸屬硬骨魚(yú)綱，是生物免疫系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上重要的分枝點(diǎn)，在魚(yú)類(lèi)乃至整個(gè)脊椎動(dòng)物進(jìn)化史上占有極其重要的地位，在2010年被世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄列為極危物種。為保護(hù)該瀕危物種，開(kāi)展了鱘魚(yú)養(yǎng)殖。隨著養(yǎng)殖集約化程度加劇，疾病的危害也越來(lái)越大，嚴(yán)重威脅鱘魚(yú)數(shù)量資源的健康發(fā)展和可持續(xù)性增長(zhǎng)。其中，鱘魚(yú)分枝桿菌病已經(jīng)成為影響?zhàn)B殖鱘魚(yú)發(fā)展的重要制約因素之一。海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)和龜分枝桿菌(M.chelonae)是魚(yú)類(lèi)常見(jiàn)的病原菌。在自然條件下，海分枝桿菌是超過(guò)150種魚(yú)類(lèi)和青蛙以及淡水鰻魚(yú)和牡蠣的病原體。海分枝桿菌由于毒力小、傳染性低、與結(jié)核分枝桿菌核苷酸同源性達(dá)85％，因此常作為二級(jí)實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)核分枝桿菌的一種優(yōu)良模型。

目前海分枝桿菌的診斷還沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。常見(jiàn)的海分枝桿菌的診斷需要先從臨床樣本中分離培養(yǎng)分枝桿菌，再通過(guò)分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌種鑒定，最終鎖定致病菌，分離培養(yǎng)依然需要至少一周到兩周時(shí)間，再加上后續(xù)菌種鑒定的耗時(shí)，極大地耽誤了確診和治療時(shí)間。DNA微陣列芯片技術(shù)不能在檢測(cè)病原菌的同時(shí)做出藥敏檢測(cè)，尚不能完全替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)和藥敏檢測(cè)，需要專(zhuān)業(yè)的芯片及掃描儀，成本較高。質(zhì)譜鑒定使用合適的前處理流程是準(zhǔn)確性的關(guān)鍵所在，對(duì)于前處理的要求高；質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)庫(kù)中未包含相應(yīng)指紋圖譜，不能準(zhǔn)確鑒定包含海分枝桿菌在內(nèi)的三種分枝桿菌。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)鱘魚(yú)感染海分枝桿菌的方法，該方法簡(jiǎn)便易行，可精準(zhǔn)靈敏的檢測(cè)出感染海分枝桿菌鱘魚(yú)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)鱘魚(yú)感染海分枝桿菌的方法，包括如下步驟：誘導(dǎo)表達(dá)海分枝桿菌毒力蛋白，將毒力蛋白與鱘魚(yú)血液混合，混合液作為檢測(cè)樣品，未加入毒力蛋白的鱘魚(yú)血液作為本底對(duì)照樣品，檢測(cè)兩種樣品中IFN-γ蛋白濃度，若檢測(cè)樣品-本底對(duì)照樣品≥14pg/mL，判定為陽(yáng)性，若檢測(cè)樣品-本底對(duì)照樣品＜14pg/mL，判定為陰性。

優(yōu)選的，所述毒力蛋白為Ag85B蛋白、Rpf蛋白中的一種或多種。

優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)表達(dá)海分枝桿菌毒力蛋白的方法包括：將Ag85B陽(yáng)性菌菌液和Rpf陽(yáng)性菌菌液添加于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)，添加IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。

優(yōu)選的，所述IPTG的添加量為0.4～1.2mmol/L。

優(yōu)選的，將毒力蛋白與鱘魚(yú)血液混合液和鱘魚(yú)血液放入25～30℃的培養(yǎng)箱中孵育20～24h。

優(yōu)選的，所述IFN-γ蛋白濃度的檢測(cè)方法為間接夾心ELISA法。

優(yōu)選的，所述間接夾心ELISA法以兔源IFN-γ多抗作為捕獲抗體，再以鼠源IFN-γ多抗作為檢測(cè)抗體。

優(yōu)選的，所述鼠源IFN-γ多抗的制備方法包括如下步驟：用IFN-γ蛋白免疫小鼠三次，第25～30天收集小鼠血清樣本，用硫酸銨鹽析法純化IFN-γ多抗，即得鼠源IFN-γ多抗。

優(yōu)選的，所述鼠源IFN-γ多抗需稀釋至1:1000～1:3000。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：