[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的引物探針組合物及試劑盒和檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211578360.0
• 申請(qǐng)日: 2022-12-06
• 公開（公告）號(hào): CN115927686A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 伊正君;付玉榮;陳柯;唐媛媛;王文濤;席志陽;王曉強(qiáng);蘇繼營(yíng);劉暢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 濰坊醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京匯捷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11531
• 代理人: 王文嬌

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的引物探針組合物及試劑盒和檢測(cè)方法。用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的組合物1包括：核苷酸序列如SEQ?NO:1?3所示；用于檢測(cè)非結(jié)核分枝桿菌的組合物2?4包括：核苷酸序列如SEQ?NO:4?12所示。本發(fā)明采用雙重RAA?LFD檢測(cè)，一次反應(yīng)實(shí)現(xiàn)四種常見分枝桿菌：結(jié)核分枝桿菌、鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合體、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌的鑒別診斷。在雙重RAA的基礎(chǔ)上引入LFD進(jìn)行快速、準(zhǔn)確且可視化檢測(cè)，極大地減低了檢測(cè)成本，縮短了檢測(cè)時(shí)間。無需昂貴機(jī)器，恒溫進(jìn)行擴(kuò)增，肉眼進(jìn)行結(jié)果判讀，具有超高的靈敏度，檢測(cè)限最高可達(dá)到單個(gè)拷貝/反應(yīng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的引物探針組合物及試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

分枝桿菌屬主要分為三大類，即結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(mycobacteriumtuberculosis?complex，MTC)、麻風(fēng)分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculousmycobacteria，NTM)。其中結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病多年來位居單一病原感染致人死亡率之首。

然而近年來NTM(非結(jié)核分枝桿菌)感染的臨床發(fā)病率不斷上升，其中最常見的為鳥胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌，約占總NTM臨床分離株的90％以上，其臨床癥狀與MTB(結(jié)核分枝桿菌)感染極為相似，但兩者治療方案卻存在很大差異。臨床診療中，NTM和MTB的精準(zhǔn)鑒別是重要的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題，亟須快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法應(yīng)用于分枝桿菌感染的菌種鑒定。

重組酶輔助等溫?cái)U(kuò)增法(recombinase?polymerase?amplification,RAA)是一種新型恒溫體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，其原理為：重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。

本方法所具備的優(yōu)勢(shì)包括：①低設(shè)備成本；②恒溫運(yùn)行，通常在37-42℃；③時(shí)間短，10min內(nèi)達(dá)到可檢測(cè)水平；④靈敏度高；⑤特異性強(qiáng)。

RAA與側(cè)流層析試紙條(Lateral?flow?dipstick，LFD)可以結(jié)合起來應(yīng)用，RAA擴(kuò)增體系中，需要生物素標(biāo)記反向引物和熒光素標(biāo)記的探針，探針可以被nfo酶識(shí)別并在DNA聚合酶作用下延伸，形成帶有生物素和熒光素雙標(biāo)記的RAA產(chǎn)物，然后將產(chǎn)物應(yīng)用LFD進(jìn)行檢測(cè)。LFD樣品端包被帶熒光素抗體的納米金粒，檢測(cè)線上包被有生物素抗體，當(dāng)反應(yīng)液進(jìn)入試紙條時(shí)，帶有熒光素和生物素的擴(kuò)增產(chǎn)物就會(huì)通過抗原抗體結(jié)合作用，在檢測(cè)線上形成復(fù)合體并顯色。檢測(cè)時(shí)間短，肉眼可判讀。

目前臨床應(yīng)用的鑒別診斷MTB和NTM的主要方法：

(1)對(duì)硝基苯甲酸選擇培養(yǎng)基法：①耗時(shí)長(zhǎng)；②無法進(jìn)行種間鑒定。

(2)線性探針雜交技術(shù)：①耗時(shí)長(zhǎng)；②成本高；③假陽性率高。

(3)DNA測(cè)序：①成本昂貴；②技術(shù)復(fù)雜；③設(shè)備限制大。

(4)細(xì)菌培養(yǎng)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定：耗時(shí)非常長(zhǎng)(1個(gè)月左右)。因此，目前急需一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、低成本的MTB和NTM鑒別方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明旨在提供了一種一次反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)四種分枝桿菌檢驗(yàn)及鑒別，快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確且可視化程度高的創(chuàng)新性檢測(cè)發(fā)明，該發(fā)明包含可用于檢測(cè)結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的引物探針組合物及試劑盒及其相應(yīng)的檢測(cè)方法。

(一)為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種用于檢測(cè)結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的引物探針組合物具體包括：

1.用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的組合物1包括：核苷酸序列如SEQ?NO:1所示的上游引物；核苷酸序列如SEQ?NO:2所示的下游引物；核苷酸序列如SEQ?NO:3所示的探針；