[發明專利]一種用于檢測結核與非結核分枝桿菌的引物探針組合物及試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 202211578360.0
• 申請日: 2022-12-06
• 公開（公告）號: CN115927686A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 伊正君;付玉榮;陳柯;唐媛媛;王文濤;席志陽;王曉強;蘇繼營;劉暢
• 申請（專利權）人: 濰坊醫學院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 王文嬌

1.一種用于檢測結核與非結核分枝桿菌的引物探針組合物，其特征是：

用于檢測結核分枝桿菌的組合物1包括：核苷酸序列如SEQ?NO:1所示的上游引物；核苷酸序列如SEQ?NO:2所示的下游引物；核苷酸序列如SEQ?NO:3所示的探針；

用于檢測非結核分枝桿菌的組合物2包括：核苷酸序列如SEQ?NO:4所示的上游引物；核苷酸序列如SEQ?NO:5所示的下游引物；核苷酸序列如SEQ?NO:6所示的探針；

用于檢測非結核分枝桿菌的組合物3包括：核苷酸序列如SEQ?NO:7所示的上游引物；核苷酸序列如SEQ?NO:8所示的下游引物；核苷酸序列如SEQ?NO:9所示的探針；

用于檢測非結核分枝桿菌的組合物4包括：核苷酸序列如SEQ?NO:10所示的上游引物；核苷酸序列如SEQ?NO:11所示的下游引物；核苷酸序列如SEQ?NO:12所示的探針。

2.根據權利要求1所述的用于檢測結核與非結核分枝桿菌的引物探針組合物，其特征在于：

所述組合物2用于檢測鳥胞內分枝桿菌復合體；所述組合物3用于檢測堪薩斯分枝桿菌；所述組合物4用于檢測膿腫分枝桿菌。

3.根據權利要求1所述的用于檢測結核與非結核分枝桿菌的引物探針組合物，其特征在于：

所述SEQ?NO:2和SEQ?NO:10的5’端用生物素Biotin進行修飾；

所述SEQ?NO:3和SEQ?NO:12的5’端用FAM進行修飾，離5’端第31位堿基用四氫呋喃THF修飾，3’端設有聚合酶延伸阻斷基團C3?spacer；

所述SEQ?NO:5的5’端用羅丹明TAMRA進行修飾；

所述SEQ?NO:6的5’端用Digxin進行修飾，離5’端第30位堿基用四氫呋喃THF修飾，3’端有聚合酶延伸阻斷基團C3?spacer；

所述SEQ?NO:8的5’端用TAMRA和Digxin進行修飾，3’端有聚合酶延伸阻斷基團C3spacer；

所述SEQ?NO:9的離5’端第32位堿基用四氫呋喃THF修飾。

4.一種用于檢測結核與非結核分枝桿菌的試劑盒，其特征在于：包括權利要求1-3任一項所述的引物探針組合物，

還包括緩沖液，無RNA酶水，乙酸鎂，含凍干粉酶的PCR管，雙標核酸檢測試紙條，陽性標準品和陰性標準品。

5.根據權利要求4所述的用于檢測結核與非結核分枝桿菌的試劑盒，其特征在于：

所述含凍干粉酶的PCR管內含有Bst聚合酶和單鏈結合蛋白；

所述陽性標準品為結核分枝桿菌、胞內分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA；

所述陰性標準品為PBS溶液。

6.一種用于檢測結核與非結核分枝桿菌的試劑盒的檢測方法，其特征在于：所述試劑盒為權利要求4-5任一項所述的試劑盒，檢測方法包括：

(1)待測樣品的基因組DNA提取；

(2)RAA擴增反應；

(3)LFD反應。

7.根據權利要求6所述的用于檢測結核與非結核分枝桿菌的試劑盒的檢測方法，其特征在于：

所述(1)通過高溫裂解法獲得。

8.根據權利要求6所述的用于檢測結核與非結核分枝桿菌的試劑盒的檢測方法，其特征在于：

所述(2)的具體步驟包括：

將(1)中的基因組DNA加入到含有反應體系的含凍干粉酶PCR管中，震蕩1s，瞬時離心1s，重復3次使其充分混勻后，將反應管轉移到金屬浴中，37℃加熱30min，陰性對照將基因組DNA替換為陰性標準品，陽性對照將基因組DNA替換為陽性標準品。

9.根據權利要求6所述的用于檢測結核與非結核分枝桿菌的試劑盒的檢測方法，其特征在于：

所述(3)的具體步驟包括：

將(2)得到的擴增產物用乙酸鎂稀釋25倍，取混合物加到雙標核酸檢測試紙條的樣品墊上，反應5min后讀取結果。