[發明專利]一種產甾藥前體的基因工程菌及其用途

在審

• 申請號: 202211559077.3
• 申請日: 2022-12-06
• 公開（公告）號: CN116286930A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 顧向忠;袁辰陽;葉如飛
• 申請（專利權）人: 江蘇佳爾科藥業集團股份有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/53;C12N1/21;C12P33/00;C07J5/00;C12R1/01
• 代理公司: 常州市天龍專利事務所有限公司 32105
• 代理人: 于雅潔

本發明公開了一種產甾藥前體的基因工程菌和用途?；虻娜笔г谡{控分枝桿菌產甾藥前體的產量或改造產甾藥前體的分枝桿菌中的用途，所述基因包括編碼羥酰輔酶A脫氫酶的基因和/或3?甾酮?9α?羥化酶A亞基的基因。本發明3?甾酮?9α?羥化酶A和羥酰輔酶A脫氫酶在分枝桿菌轉化甾醇過程中具有重要的調控作用。同時本發明還構建了一種產甾藥前體的基因工程菌，將基因工程菌接種到以甾醇為底物的培養基中發酵，能得到純度高、產量高的甾藥前體21?羥基?20?甲基孕甾?1,4?二烯?3?酮，其能作為原料合成潑尼松龍、醋酸潑尼松龍等甾體藥物，因此在工業上具有潛在而廣泛的應用價值。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種產甾藥前體的基因工程菌及其用途。

背景技術

甾體藥物應用廣泛，包括治消炎、抗過敏等多種醫療應用。甾體藥物目前市場規模較大，已成為僅次于抗生素的第二大類藥物，并且具有較好的市場前景。主流甾體藥物的合成路線有兩條，一條是以薯蕷皂素為原料，通過化學合成生成中間體雙烯醇酮醋酸酯，再經過后續反應，可以得到黃體酮、氫化可的松等藥物；該路線以化學合成為主，但其反應線路長、收率低，對環境會造成污染，并且生產成本較高。另一條路線是植物甾醇為原料，利用微生物的代謝，將其轉化成不同的甾藥前體，例如雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)、1,4-雄甾二烯-3,17-二酮(ADD)和9α羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)等甾藥前體，再經過化學合成制備成目標甾體藥物。該路線的原料來源穩定、反應路線短、收率高、生產成本低且更加環保，因此目前逐漸成為生產甾藥前體的主流工藝。但是甾體藥物行業利用微生物轉化的甾藥前體大多是C19類甾體，C22類甾體的開發也僅限21-羥基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(4-HP)而缺乏其他甾藥前體，限制了甾體藥物行業的發展。

分枝桿菌等微生物具有代謝甾醇等天然固醇的能力，因此通過控制微生物降解甾醇類物質過程中的各種酶的活性，可以獲得多種重要的甾藥前體。但是，由于甾醇降解是多酶參與的多步反應過程，加之對側鏈代謝分子機制的不甚了解，目前也僅有可生產AD、ADD、9α-OH-AD、4-HP和睪酮等少數幾個甾藥前體的工程菌株被構建，遠不能滿足行業的需求。

21-羥基-20-甲基孕甾-1,4-二烯-3-酮，英文名為21-hydroxy-20-methyl-pregna-1,4-dien-3-one(簡稱1,4-HP)，是一種新型的C22類甾藥前體。由于1,4-HP的C1-C2位為雙鍵，并且C17側鏈保留了類似皮質類激素的側鏈結構，因此，和傳統C19類甾藥前體(ADD和9α-OH-AD等)相比，1,4-HP更適合作為甾藥前體用于合成潑尼松龍等皮質類激素甾體藥物。因此，1,4-HP生產菌種的開發對促進傳統甾藥生產體系的革新具有重要意義。但是，目前生產1,4-HP的菌株的產量、純度及轉化率未能盡如人意，生產過程中存在較多副產物，給后續的分離純化造成了困難。

因此，如何獲得高效、專一的可轉化甾醇生產甾藥前體，特別是1,4-HP的優良菌種成為甾體醫藥行業的迫切需求。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種產甾藥前體的基因工程菌和用途，以期解決現有技術中存在的問題。

為實現上述目的，本發明具體采用如下技術方案。

本發明的第一方面保護，基因在調控分枝桿菌產甾藥前體的產量或改造產甾藥前體的分枝桿菌中的用途，所述基因為編碼羥酰輔酶A脫氫酶的基因和/或3-甾酮-9α-羥化酶A亞基的基因。通過研究意外發現敲除編碼羥酰輔酶A脫氫酶的基因和/或3-甾酮-9α-羥化酶A亞基的基因能提高分枝桿菌產甾藥前體的產量，特別是21-羥基-20-甲基孕甾-1，4-二烯-3-酮(1,4-HP)的產量。

根據本發明的技術方案，所述編碼3-甾酮-9α-羥化酶A亞基的基因為如下A1)-A4)中的至少一項；

A1)所述基因為kshA1；所述kshA1的核苷酸序列包括如SEQ?ID?NO.1所述序列；