[發明專利]一種鑒別紅松無性系的SSR標記引物組及指紋圖譜的構建方法和應用

有效

• 申請號: 202211550520.0
• 申請日: 2022-12-05
• 公開（公告）號: CN116200521B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 張含國;閆平玉;張磊;唐杰;趙常海;楊偉財;潘鳳剛;張振;程萬才
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 李紅媛

1.一種基于毛細管電泳技術鑒別紅松無性系的SSR標記引物組，其特征在于所述的引物組由以下引物組成：

標記p49上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?IDNO.2所示；

標記p70上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?IDNO.4所示；

標記p72上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?IDNO.6所示；

標記p79上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?IDNO.8所示；

標記p82上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?IDNO.10所示；

標記EPD11上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.11所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?IDNO.12所示；

標記NFPK-34上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.13所示，下游引物核苷酸序列如SEQID?NO.14所示；

標記P6*上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.15所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?IDNO.16所示；

標記P45*上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.17所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?IDNO.18所示；

標記P51*上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.19所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?IDNO.20所示和

標記P52*上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.21所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?IDNO.22所示。

2.根據權利要求1所述的一種基于毛細管電泳技術鑒別紅松無性系的SSR標記引物組，其特征在于所述標記p49的上游引物、標記p70的上游引物、標記P6*的上游引物的5’端均連接有熒光標簽FAM；

所述標記p72的上游引物、標記p79的上游引物、標記P45*的上游引物的5’端均連接有熒光標簽HEX；

所述標記p82的上游引物、標記P52*的上游引物的5’端均連接有熒光標簽ROX；

所述標記EPD11的上游引物、標記NFPK-34的上游引物、標記P51*的上游引物的5’端均連接有熒光標簽TAM。

3.一種基于毛細管電泳技術鑒別紅松無性系的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒含有權利要求1或2?的SSR標記引物組。

4.如權利要求1所述的一種基于毛細管電泳技術鑒別紅松無性系的SSR標記引物組在紅松無性系鑒定和構建紅松無性系SSR指紋圖譜中的應用。

5.采用權利要求1或2所述的一種基于毛細管電泳技術鑒別紅松無性系的SSR標記引物組的構建指紋圖譜的方法，其特征在于所述的構建構建指紋圖譜的方法如下：

（1）紅松基因組DNA提取；

（2）以步驟（1）提取的紅松總DNA樣品為模板，采用權利要求1或2所述的11對引物進行PCR擴增，制得PCR擴增產物；

（3）使用毛細管電泳檢測步驟（2）獲得的?PCR擴增產物等位基因數目及大小；

（4）根據步驟（3）的檢測結果，形成紅松無性系的SSR指紋圖譜。

6.根據權利要求5所述的構建指紋圖譜的方法，其特征在于步驟（2）中的擴增體系為10μL：

。

7.根據權利要求5所述的構建指紋圖譜的方法，其特征在于步驟（2）中的PCR擴增的反應程序為：94℃預變性3分鐘；?94℃變性30秒，Tm下退火30秒，72°延伸15秒，35個循環；72℃延伸7分鐘。

8.根據權利要求5所述的構建指紋圖譜的方法，其特征在于步驟（3）中毛細管電泳檢測的步驟為：取步驟（2）的PCR擴增產物各0.3μL、分子量內標0.5μL和去離子甲酰胺9.5μL?混合加入PCR板，95℃變性5min，4℃冷卻后離心，1×Buffer緩沖液上機檢測。