[發(fā)明專利]藍(lán)光誘導(dǎo)釀酒酵母定點(diǎn)DSB系統(tǒng)的構(gòu)建

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211547580.7
• 申請日: 2022-12-05
• 公開（公告）號: CN115960945A
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周颯;李佳瑤;馬文建;宋國棟;牛家蕾;吳恒宇;吉南希
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/113;C12N15/55;C12R1/865
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發(fā)明涉及一種藍(lán)光誘導(dǎo)釀酒酵母定點(diǎn)DSB系統(tǒng)，構(gòu)建步驟如下:構(gòu)建site?I?SceI?KanM轉(zhuǎn)化盒，利用pC120?El222藍(lán)光誘導(dǎo)型啟動子,利用PEG/LiAC法向酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，即得藍(lán)光誘導(dǎo)釀酒酵母定點(diǎn)DSB系統(tǒng)。本發(fā)明以釀酒酵母為載體，利用藍(lán)光介導(dǎo)調(diào)節(jié)歸位內(nèi)切酶I?SceI表達(dá)，并建立的定點(diǎn)DSB誘導(dǎo)系統(tǒng),并驗(yàn)證了系統(tǒng)的可行性。本發(fā)明的提供的藍(lán)光誘導(dǎo)釀酒酵母定點(diǎn)DSB系統(tǒng)，在藍(lán)光誘導(dǎo)下，無毒無害、相應(yīng)迅速，操作簡單，可逆性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及藍(lán)光誘導(dǎo)釀酒酵母定點(diǎn)DSB系統(tǒng)的構(gòu)建。

背景技術(shù)

釀酒酵母廣泛用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究和食品，藥品以及化學(xué)材料料的生產(chǎn)。釀酒酵母作為真核模式生物，是分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中研究最深入的生物模型。釀酒酵母不僅具有操作簡單，容易培養(yǎng)等特點(diǎn)，而且釀酒酵母自然HRR效率比較高，在外源DNA轉(zhuǎn)入后，依賴自身的重組便可以實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)入，可以較為容易的構(gòu)建各種基因突變體模型。

I-SceI是一類由內(nèi)含子編碼的歸位內(nèi)切酶，編碼I-SceI內(nèi)切酶的氨基酸有235個(gè)，此內(nèi)切酶具有特異性，能特異性的識別特定堿基序列發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的活性，I-SceI的識別序列為18個(gè)非對稱核苷酸序列(TAGGGATAACAGGGTAAT)，在特異性的酶切核酸后，可以產(chǎn)生一個(gè)4bp的切口。I-SceI誘導(dǎo)的DSB可以用于體外與體內(nèi)研究DNA的重組。

在釀酒酵母，最常用的是依賴營養(yǎng)擾動的表達(dá)系統(tǒng)，通常使用的轉(zhuǎn)錄因子為(TF)Gal4p，當(dāng)含有Gal4p識別序列(UAS?GAL)時(shí)，啟動子控制的靶基因可以在半乳糖存在下選擇性誘導(dǎo)，此系統(tǒng)很難在空間和時(shí)間上精確的控制基因的表達(dá)。光是一種理想的表達(dá)誘導(dǎo)物，可控性強(qiáng)、無毒性，而且能實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)在時(shí)空上的雙重精準(zhǔn)控制。

該光控系統(tǒng)是以來源于山葡萄紅桿菌(Erythrobacter?litoralis)的EL222光敏蛋白為轉(zhuǎn)錄因子與C120DNA結(jié)合序列為基礎(chǔ)的藍(lán)光調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)中，EL222由222個(gè)氨基酸組成，N端為光氧化調(diào)控域(LOV)，C端為螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)DNA結(jié)合域，LOV的C末端與LOV和HTH的Jα螺旋連接。LOV的核心是PAS結(jié)構(gòu)域，可與黃素單核苷酸(FMN)結(jié)合。在藍(lán)光照射下，F(xiàn)MN和LOV的結(jié)合導(dǎo)致Jα螺旋從PAS搖擺，從而釋放HTH，使EL222二聚并與DNA結(jié)合。在黑暗中，N端LOV結(jié)構(gòu)域抑制DNA結(jié)合的C端HTH結(jié)構(gòu)域時(shí)，EL222自發(fā)地逆轉(zhuǎn)，從而迅速使EL222失活。該系統(tǒng)可突破時(shí)空上的限制精準(zhǔn)的控制基因表達(dá)。藍(lán)光誘導(dǎo)釀酒酵母定點(diǎn)產(chǎn)生DSB，可作為釀酒酵母DNA損傷修復(fù)機(jī)制的又一模式菌株。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種藍(lán)光誘導(dǎo)釀酒酵母定點(diǎn)DSB系統(tǒng)。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種藍(lán)光誘導(dǎo)釀酒酵母定點(diǎn)DSB系統(tǒng)，步驟如下：

(1)構(gòu)建site-I-SceI-kanMX轉(zhuǎn)化盒，利用pC120-El222藍(lán)光誘導(dǎo)型啟動子，通過PEG/LiAC法向釀酒酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，即得到藍(lán)光誘導(dǎo)釀酒酵母定點(diǎn)DSB系統(tǒng)，同時(shí)構(gòu)建半乳糖啟動子啟動site-I-SceI-kanMX轉(zhuǎn)化盒，作為對照。

構(gòu)建site-I-SceI-kanMX轉(zhuǎn)化盒時(shí)，I-SceI酶識別位點(diǎn)site序列為SEQ?IDNO.1TAGGGATAACAGGGTAAT

構(gòu)建了一種在真核生物中藍(lán)光誘導(dǎo)的啟動子pC120-EL222，所述啟動子中包括能夠表達(dá)藍(lán)光調(diào)節(jié)啟動子pC120、藍(lán)光蛋白SV40-VP-El222以及啟動藍(lán)光蛋白的GAPpromoter和AOX1terminator。所述藍(lán)光蛋白SV40-VP-EL中的SV40為核定位信號SV40，VP為轉(zhuǎn)錄激活域VP16，EL222為藍(lán)光響應(yīng)蛋白；所述啟動子的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2