[發明專利]一種高靈敏度定量檢測SEB的方法

在審

• 申請號: 202211545559.3
• 申請日: 2022-12-05
• 公開（公告）號: CN115792236A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 范黎;劉玉桃;宋朝君;胡錦偉;朱鈺璞;馬政君;崔敏萱
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍空軍軍醫大學
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N21/31;G01N33/68;G01N33/532
• 代理公司: 北京智永源知識產權代理事務所(普通合伙) 11967
• 代理人: 李騰

本發明公開了一種高靈敏度定量檢測SEB的方法，其包括如下步驟：先制備直徑為15?80nm的AuNP顆粒；然后采用共價交聯法制備AuNP標記的SEB檢測抗體；依照雙抗體夾心法的步驟，生成基于AuNP粒子偶聯檢測抗體檢測SEB的雙抗體夾心復合物，通過石墨爐原子吸收法分別測定所述雙抗體夾心復合物中金原子的含量，依據標準曲線得到待測樣品中SEB濃度。本發明定量檢測SEB的方法具有穩定性佳，特異性強，靈敏度高，重復性好的特點。

技術領域

本發明涉及化學分析檢測技術領域，涉及一種定量檢測SEB的方法，具體地說，涉及一種基于金納米粒子偶聯檢測抗體的雙抗體夾心和石墨爐原子吸收光譜技術構建高靈敏度定量檢測SEB的方法。

背景技術

B型葡萄球菌腸毒素(Staphylococal enterotoxin B，SEB)是聯合國《禁止生物武器公約》核查清單中的11種生物毒素之一，是葡萄球菌腸毒素家族中毒性最強的一個成員。SEB的主要致病機制為大量活化T細胞，活化的T細胞群釋放大量細胞因子如IFN-γ,TNF-α等，形成“細胞因子風暴”，致使機體產生毒性休克綜合征(toxic shock syndrome,TSS)并最終導致死亡。

SEB在平時危害性也非常巨大。這主要表現在：1.毒性大、感染劑量小，極少量毒素進入人和動物機體便會引起發病甚至死亡；2.無色、無味，容易污染食物、水源等；3.污染范圍廣，容易造成民眾恐慌和社會混亂。SEB對人類的致病劑量極低，其半數有效量(ED50)為0.4ng/kg，半數致死量也僅為20ng/kg。因此，建立檢測痕量SEB的高靈敏度方法，不僅對反恐怖戰爭和反生物武器戰爭具有非常重要的意義，同時對平時的食品安全監測也具有重要意義。

目前，檢測SEB的方法主要包括以下四種檢測方法：酶聯免疫吸附測定(ELISA)、酶聯免疫化學發光檢測法(CLIA)、電化學發光免疫檢測(ECLI)、免疫層析檢測法。酶聯免疫吸附測定(ELISA)是目前應用最廣的SEB檢測法，但靈敏度欠佳，檢測時間較長。酶聯免疫化學發光檢測法(CLIA)檢測的線性范圍和靈敏度均優于ELISA方法，應用前景廣闊，但其發光強度易受外界環境干擾，并且會隨時間漂移。電化學發光免疫檢測(ECLI)將電化學發光(ECL)與免疫測定相結合，具有靈敏度高、檢測速度快、自動化程度高等特點，但設備體積大且操作復雜。免疫層析檢測法已經廣泛應用于復雜現場中的樣品檢測。但由于該法所使用的標記物(膠體金)本身性質的限制，檢測靈敏度低是制約免疫層析檢測法進一步發展的瓶頸。在上述檢測方法中，CLIA的檢測靈敏度最高，也僅為0.01ng/mL，不能完全滿足反恐怖戰爭、反生物武器戰爭及食品安全監測方面的需要。因此，更高靈敏度的痕量SEB定量檢測方法依然是目前亟需。

目前，提升SEB檢測靈敏度的策略主要集中在酶標記物和底物兩個方面。酶標記物活性的提升的根本在于酶的活性和酶標記物中酶的含量。酶的活性方面，以最常用的辣根過氧化物酶(HRP)為例，目前市售的HRP的比活性為400U/mg，短時間內提升的空間有限。提升酶標記物中酶的含量的常用方法是引入放大系統，最常用的是生物素-親和素放大系統。放大系統的引入在一定程度上可以增加檢測靈敏度，但同時也會引起操作步驟復雜化和背景的增加，信噪比下降，尤其是在一些肉類食品基質中含有內源性生物素，會極大的影響檢測結果的準確性。

因此，基于酶標記物的SEB檢測方法的提升空間有限，故尋求新的檢測抗體標記物和檢測方法學是提升SEB檢測靈敏度的有效途徑。

發明內容

為了克服上述技術問題，本發明的目的在于提供了一種基于金納米粒子偶聯檢測抗體的雙抗體夾心和石墨爐原子吸收光譜技術構建高靈敏度定量檢測SEB的方法。

經過多年研究，發明人探索出在雙抗體夾心法檢測SEB的基礎上，用AuNP代替辣根過氧化物酶(HRP)標記檢測抗體，制備用金納米粒子(AuNP)作為標記物的SEB檢測抗體以及建立雙抗體夾心復合物，并結合石墨爐原子吸收光譜法(GAAFS)檢測AuNP中金原子的含量，以金原子的含量和SEB標準品濃度繪制標準曲線，建立一種高靈敏度的定量檢測SEB的分析方法。