[發明專利]一種高靈敏度定量檢測SEB的方法

在審

• 申請號: 202211545559.3
• 申請日: 2022-12-05
• 公開（公告）號: CN115792236A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 范黎;劉玉桃;宋朝君;胡錦偉;朱鈺璞;馬政君;崔敏萱
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍空軍軍醫大學
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N21/31;G01N33/68;G01N33/532
• 代理公司: 北京智永源知識產權代理事務所(普通合伙) 11967
• 代理人: 李騰

1.一種高靈敏度定量檢測SEB的方法，其特征在于，其包括如下步驟：

1)制備AuNP顆粒：

通過檸檬酸鈉還原法和二次生長法制備直徑為15-80nm的AuNP顆粒；

2)采用共價交聯法制備AuNP標記的SEB檢測抗體：

在堿性條件下先將所述AuNP顆粒的溶液中加入配體對AuNP進行修飾，并利用酰胺鍵偶聯劑活化AuNP表面的-COOH再與SEB檢測抗體形成共價結合，得到AuNP標記的SEB檢測抗體；

3)依照雙抗體夾心法的步驟生成基于AuNP粒子偶聯檢測抗體檢測SEB的雙抗體夾心復合物：

先將SEB捕獲抗體經包被緩沖液稀釋后加入ELISA板中放置，然后加入SEB標準品孵育，再加入所述AuNP標記的SEB檢測抗體孵育，形成雙抗體夾心復合物；所述SEB標準品為不同濃度的SEB標準品，對應形成不同濃度的標準系列的雙抗體夾心復合物；

4)以金原子的含量和SEB標準品濃度繪制標準曲線：

先分別將強酸溶解步驟3)得到的不同濃度的標準系列的雙抗體夾心復合物，然后通過GAAFS分別測定所述雙抗體夾心復合物中不同金原子的含量，繪制以金原子的含量和SEB標準品濃度的標準曲線；

5)定量檢測待測樣品的SEB濃度：

將待測樣品依據步驟3)，與AuNP標記的SEB檢測抗體以及SEB捕獲抗體形成待測雙抗體夾心復合物；然后依據步驟4)通過GAAFS測定待測樣品的金原子的含量，依據標準曲線得到待測樣品中SEB濃度。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述檸檬酸鈉還原法采用先將四氯金酸溶液加熱至沸騰，然后迅速加入檸檬酸鈉溶液并攪拌，直到AuNP膠體形成。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述二次生長法采用先將所述AuNP膠體水溶液加入還原劑中進行攪拌，然后慢慢加入四氯金酸溶液，最終獲得所需直徑的AuNP膠體。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述AuNP顆粒的直徑為40-80nm。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述堿性條件為pH為9-11；所述配體為HS-PEG-COOH或十一巰基十一烷酸；所述酰胺鍵偶聯劑為EDC、NHS或馬來酰亞胺。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述配體的濃度為0.01-0.02mmol/L；所述酰胺鍵偶聯劑的濃度為1-1.5mmol/L。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述AuNP與所述SEB檢測抗體的用量比為1:1-1.2。

8.根據權利要求1或7所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述SEB捕獲抗體的濃度為5-10μg/mL，所述AuNP標記的SEB檢測抗體的濃度為1-5μg/mL。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，先經強酸溶解處理所述雙抗體夾心復合物10-20min，然后經煮沸再通過石墨爐原子吸收光譜儀檢測金原子。

10.一種采用權利要求1-9任意一項所述方法用于檢測SEB含量中的應用。