[發(fā)明專利]一種細(xì)胞外囊泡裝載金納米顆粒的方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202211529706.8
• 申請日: 2022-12-01
• 公開（公告）號: CN115721738A
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔大祥;朱君;朱競堯;楊晚晴;姚晶晶;徐艷;楊迪誠
• 申請（專利權(quán)）人: 國納之星（上海）納米科技發(fā)展有限公司;上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: A61K49/04
• 分類號: A61K49/04
• 代理公司: 上海東亞專利商標(biāo)代理有限公司 31208
• 代理人: 董梅

本發(fā)明涉及一種細(xì)胞外囊泡裝載金納米顆粒的方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，金納米顆粒經(jīng)過聚乙二醇與細(xì)胞穿膜肽修飾后，與細(xì)胞外囊泡共孵育將其轉(zhuǎn)載至細(xì)胞外囊泡中，使用尺寸排阻色譜柱去除游離的金納米顆粒。獲得最終產(chǎn)物可用于生物CT成像等方面。本發(fā)明可應(yīng)用于不同來源的細(xì)胞外囊泡的提取與金納米顆粒的裝載，制備方法簡單，利用細(xì)胞外囊泡的生物相容性好、靶向特定組織特點，提高CT對比劑的組織特異性，為臨床靶向遞送系統(tǒng)的制備提供新思路。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種細(xì)胞外囊泡外源性裝載金納米顆粒的方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。金納米顆粒經(jīng)過聚乙二醇與細(xì)胞穿膜肽修飾后，與細(xì)胞外囊泡共孵育將其轉(zhuǎn)載至細(xì)胞外囊泡中，使用尺寸排阻色譜柱去除游離的金納米顆粒。獲得最終產(chǎn)物可用于生物CT成像等方面。

背景技術(shù)

金納米顆粒具有獨特的光電、物化性質(zhì)及良好的生物相容性。在腫瘤的顯像方面的檢測能力比現(xiàn)在常用的造影劑高出幾個數(shù)量級。

細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞分泌并釋放到外基質(zhì)的膜性小囊泡，廣泛存在于生物體液中，參與細(xì)胞間信號傳遞、細(xì)胞遷移、血管新生和腫瘤細(xì)胞生長等多種過程。近年來在藥物遞送領(lǐng)域的潛力受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛研究和關(guān)注，與人工脂質(zhì)體相比，細(xì)胞外囊泡具有更大的載藥能力、更好的生物相容性且具備靶向特定組織的功能。目前，細(xì)胞外囊泡的藥物裝載方法主要分為兩種，即內(nèi)源性裝載或外源性裝載。內(nèi)源性裝載指在母源細(xì)胞上進(jìn)行操作完成藥物裝載，如細(xì)胞轉(zhuǎn)染法、藥物與細(xì)胞共孵育法。這些方法的局限性在于載藥量有限，且僅適用于細(xì)胞培養(yǎng)來源的細(xì)胞外囊泡的裝載，而生物體液來源、植物組織來源的細(xì)胞外囊泡則無法使用該種裝載方法。外源性裝載指在提取細(xì)胞外囊泡之后進(jìn)行藥物裝載，包括電穿孔法、反復(fù)凍融法、擠壓法、超聲振蕩法等。外源性裝載的局限性有裝載率低，破壞膜結(jié)構(gòu)等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種細(xì)胞外囊泡裝載金納米顆粒的方法。

本發(fā)明的再一目的在于：提供一種上述方法制備的細(xì)胞外囊泡裝載金納米顆粒產(chǎn)品。

本發(fā)明的又一目的在于：提供一種上述產(chǎn)品的應(yīng)用。

本發(fā)明目的通過下述方案實現(xiàn)：通過檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒，使用巰基聚乙二醇和細(xì)胞穿膜肽修飾。超速離心法獲得細(xì)胞外囊泡，將金納米顆粒與細(xì)胞外囊泡共孵育后，使用尺寸色譜排阻柱去除游離的金納米顆粒，獲得細(xì)胞外囊泡裝載的金納米顆粒。

發(fā)明包括以下步驟：一種細(xì)胞外囊泡裝載金納米顆粒的方法，其特征在于，金納米顆粒經(jīng)過聚乙二醇與細(xì)胞穿膜肽修飾后，與細(xì)胞外囊泡共孵育將其轉(zhuǎn)載至細(xì)胞外囊泡中，使用尺寸排阻色譜柱去除游離的金納米顆粒，包括以下步驟：

（1）金納米顆粒的制備：取0.01% HAuCl₄ 水溶液100 mL，加熱至沸騰，在磁力攪拌下加入1 %的Na₃Cit 水溶液，繼續(xù)煮沸15 min，冷卻后以去離子水恢復(fù)到原體積，離心3次用去離子水重懸備用；

（2）金納米顆粒的修飾：稱取SH-PEG₅₀₀₀-Alkyl(C_nH_2n)和SH-PEG₅₀₀₀-OCH₃，按照摩爾比為1：99的配比，20 PEG molecule/nm² 的濃度加入至AuNPs溶液中，在超聲振蕩下反應(yīng)1h，獲得PEG-AuNPs 離心3次，使用去離子水重懸。稱取CPP多肽，與PEG-AuNPs按一定比例混合，4℃ 共孵育過夜，獲得CPP-PEG-AuNPs，離心3次去除未結(jié)合的CPP；

（3）細(xì)胞外囊泡的提取：500 mL細(xì)胞上清或生物液體依次經(jīng)過500 g (10 min) 、2000 g (20 min)、15000 g (30 min) 4℃離心，去沉淀。離心后的液體過0.22 μm的濾膜。120000 g 離心90 min 棄上清，保留沉淀，用PBS吹打重懸沉淀。120000 g離心90 min 純化EV，棄上清，使用500 μL的PBS重懸，獲得細(xì)胞外囊泡；