[發明專利]一種細胞外囊泡裝載金納米顆粒的方法及其產品和應用

在審

• 申請號: 202211529706.8
• 申請日: 2022-12-01
• 公開（公告）號: CN115721738A
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發明（設計）人: 崔大祥;朱君;朱競堯;楊晚晴;姚晶晶;徐艷;楊迪誠
• 申請（專利權）人: 國納之星（上海）納米科技發展有限公司;上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: A61K49/04
• 分類號: A61K49/04
• 代理公司: 上海東亞專利商標代理有限公司 31208
• 代理人: 董梅

1.一種細胞外囊泡裝載金納米顆粒的方法，其特征在于，金納米顆粒經過聚乙二醇與細胞穿膜肽CPP修飾后，與細胞外囊泡共孵育將其轉載至細胞外囊泡中，使用尺寸排阻色譜柱去除游離的金納米顆粒，包括以下步驟：

（1）金納米顆粒的制備：取0.01% HAuCl₄ 水溶液100 mL，加熱至沸騰，在磁力攪拌下加入1 %的檸檬酸鈉Na₃Cit 水溶液，繼續煮沸15 min，冷卻后以去離子水恢復到原體積，離心3次用去離子水重懸，得到金納米AuNPs溶液備用；

（2）金納米顆粒的修飾：稱取烷基封端的聚乙二醇SH-PEG₅₀₀₀-Alkyl(C_nH_2n)和SH-PEG₅₀₀₀-OCH₃，按照摩爾比為1：99的配比，20 PEG molecule/nm² 的濃度加入至AuNPs溶液中，在超聲振蕩下反應1 h，獲得PEG-AuNPs 離心3次，使用去離子水重懸；稱取細胞穿膜肽CPP，與PEG-AuNPs按一定比例混合，4℃ 共孵育過夜，獲得CPP-PEG-AuNPs，離心3次去除未結合的CPP；

（3）細胞外囊泡的提?。?00 mL細胞上清或生物液體，在4℃依次經過500 g (10 min)、2000 g (20 min)、15000 g (30 min)離心，去沉淀；離心后的液體過0.22 μm的濾膜；120000 g 離心90 min 棄上清，保留沉淀，用PBS吹打重懸沉淀；120000 g離心90 min 純化EV，棄上清，使用500 μL的PBS重懸，獲得細胞外囊泡；

（4）AuNPs的裝載：500 μL 的細胞外囊泡與500 μL的CPP-PEG-AuNPs混合4℃搖床共孵育過夜，使用尺寸色譜排阻柱去除游離的AuNPs。

2.根據權利要求1所述的一種細胞外囊泡裝載金納米顆粒的方法，其特征在于，步驟（2）中所述的烷基封端的聚乙二醇SH-PEG5000-Alkyl烷基鏈長度（n）為6-18；所述的多肽（CPP）包括但不限于細胞穿膜肽Cys-TAT 、Cys-R8的N端殘基為半胱氨酸細胞穿膜肽。

3.根據權利要求1所述的一種細胞外囊泡裝載金納米顆粒的方法，其特征在于，步驟（3）中，細胞系選擇包括SKOV-3人卵巢癌細胞系、HCT116人結腸癌細胞系、A549人肺癌細胞系；所述的生物液體包括尿液、血漿。