[發(fā)明專利]一種用于改進(jìn)植物源樣品高通量擴(kuò)增子測(cè)序的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211524947.3
• 申請(qǐng)日: 2022-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115786577A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王博茜;李清心;吳金川
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 陳潔娣

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于改進(jìn)植物源樣品高通量擴(kuò)增子測(cè)序的方法。該方法是通過(guò)qPCR實(shí)現(xiàn)不同樣品最適PNA用量的判定和在第一次PCR中添加適量的定向PNA的方法實(shí)現(xiàn)。采用本發(fā)明方法能夠有效抑制16SrRNA擴(kuò)增子測(cè)序中宿主葉綠體、線粒體的擴(kuò)增，減少測(cè)序結(jié)果中誤差，提高測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于改進(jìn)植物源樣品高通量擴(kuò)增子測(cè)序的方法。

背景技術(shù)

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，16SrRNA(small subunit ribosomal RNA)擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)不斷成熟，已經(jīng)成為解析微生物群落構(gòu)造的常用和通用方法。在植物內(nèi)源菌群或有植物樣本參與的測(cè)序中往往會(huì)出現(xiàn)宿主污染的情況，污染片段可高達(dá)總片段數(shù)的80-90％，這主要是由于植物葉綠體、線粒體的基因序列與細(xì)菌的基因序列有著高度同源性。如何能夠有效減輕宿主基因的污染，是以植物為樣本源的16SrRNA擴(kuò)增子測(cè)序中需要避免的關(guān)鍵問(wèn)題。

肽核酸(PNA,peptide nucleic acid)是一種人工合成的類似于DNA或RNA的聚合物。由于PNA不帶負(fù)電荷，它與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性大大提高。不同于DNA或DNA、RNA間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠(yuǎn)優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA。PNA具有雜交穩(wěn)定性高、特異序列識(shí)別能力強(qiáng)、不易被DNA酶和蛋白酶水解的特性。

鑒于PNA的諸多特性，它被使用在16SrRNA測(cè)序中，利用其緊密且特異地結(jié)合目標(biāo)污染片段，物理地阻斷其擴(kuò)增，降低PCR擴(kuò)增中的偏差、提高測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性。

由于不同植物物種進(jìn)化的差異性，其提取DNA中的葉綠體、線粒體片段含量存在較大差異，造成不同物種在16SrRNA測(cè)序中出現(xiàn)的宿主基因污染程度有較大差別。如何針對(duì)不同植物物種或樣品選取最適PNA用量，有效結(jié)合非目的片段，提高16SrRNA目的片段的占比，降低PCR擴(kuò)增中的偏差、提高測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性是植物源樣品16SrRNA擴(kuò)增子測(cè)序中急需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于改進(jìn)植物源樣品高通量擴(kuò)增子測(cè)序的方法。該方法用于16SrRNA擴(kuò)增子測(cè)序中，針對(duì)不同宿主樣品判定PNA最適用量，抑制葉綠體、線粒體片段擴(kuò)增，降低非目標(biāo)片段在測(cè)序結(jié)果中的占比，提高植物源樣品在16SrRNA測(cè)序中結(jié)果的準(zhǔn)確度。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種用于改進(jìn)植物源樣品高通量擴(kuò)增子測(cè)序的方法，包括以下步驟：

(1)提取植物樣品DNA，并進(jìn)行純化；

(2)取純化后的植物DNA樣品，加入不同濃度梯度的定向PNA，使用引物515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’對(duì)16SrRNA的V4區(qū)域進(jìn)行qPCR擴(kuò)增；根據(jù)qPCR擴(kuò)增結(jié)果判定最適PNA濃度；

(3)取純化后的植物DNA樣品，加入最適濃度的定向PNA，使用帶有結(jié)合體的引物515F：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806R：

5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，得到第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(4)對(duì)第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，隨后加入帶有特定條碼的引物2nd-F：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-Index2-ACACTCTTTCCCTACACGACGC-3’和2nd-R：