[發明專利]一種用于改進植物源樣品高通量擴增子測序的方法

在審

• 申請號: 202211524947.3
• 申請日: 2022-11-30
• 公開（公告）號: CN115786577A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 王博茜;李清心;吳金川
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院生物與醫學工程研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 陳潔娣

1.一種用于改進植物源樣品高通量擴增子測序的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取植物樣品DNA，并進行純化；

(2)取純化后的植物DNA樣品，加入不同濃度梯度的定向PNA，使用引物515F：

5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’對16SrRNA的V4區域進行qPCR擴增；根據qPCR擴增結果判定最適PNA濃度；

(3)取純化后的植物DNA樣品，加入最適濃度的定向PNA，使用帶有結合體的引物515F：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’

和806R：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3’進行第一次PCR擴增，得到第一次PCR擴增產物；

(4)對第一次PCR擴增產物進行純化，隨后加入帶有特定條碼的引物2nd-F：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-Index2-ACACTCTTTCCCTACACGACG C-3’和2nd-R：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-Index1-GTGACTGGAGTTCAGA CGTGTG-3’進行第二次PCR擴增，將第二次PCR擴增產物進行純化，然后測序。

2.根據權利要求1所述的用于改進植物源樣品高通量擴增子測序的方法，其特征在于，所述的定向PNA包括抑制線粒體擴增mPNA和抑制葉綠體擴增pPNA。

3.根據權利要求2所述的用于改進植物源樣品高通量擴增子測序的方法，其特征在于，所述的抑制線粒體擴增mPNA的序列為：5’-GGCAAGTGTTCTTCGGA-3’；所述的抑制葉綠體擴增pPNA的序列為：5’-GGCTCAACCCTGGACAG-3’。

4.根據權利要求1所述的用于改進植物源樣品高通量擴增子測序的方法，其特征在于，所述的qPCR擴增程序為：預變性95℃，45s；變性35個循環95℃，15s，PNA退火78℃，10s；引物退火50℃，30s；擴增72℃，30s。

5.根據權利要求1所述的用于改進植物源樣品高通量擴增子測序的方法，其特征在于，所述的第一次PCR擴增程序為：預變性95℃，45s；95℃持續15s，PNA退火78℃持續10s，引物退火50℃持續30s，延伸72℃持續30s，進行35個循環。

6.根據權利要求1所述的用于改進植物源樣品高通量擴增子測序的方法，其特征在于，所述的第二次PCR擴增程序為：預變性94℃持續2min；94℃持續30s，60℃持續30s，72℃持續30s進行12個循環；72℃持續5min。

7.根據權利要求1所述的用于改進植物源樣品高通量擴增子測序的方法，其特征在于，所述的測序是進行雙末端2×250bp Illumina測序。