[發明專利]一種具有成骨活性的氨基酸片段Z01及其篩選和應用

在審

• 申請號: 202211520130.9
• 申請日: 2022-11-30
• 公開（公告）號: CN115785258A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 張馳
• 申請（專利權）人: 北京大學國際醫院
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C12N15/85;C12N15/65;A61K38/40;A61P19/10;C12Q1/02
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 徐翔

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種具有成骨活性的氨基酸片段Z01及其篩選和應用。本發明自建了特有針對Osx的細胞篩選平臺：CL?Osx?EGFP細胞株。該細胞篩選平臺將Osx和EGFP融合，EGFP作為跟蹤標記，能直接反映Osx的表達變化，篩選出能激活Osx的化合物。最早發現Z01可以有效激活Osx，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。對Z01進行藥代動力學分析和毒理學檢測，最后在去卵巢大鼠的骨質疏松動物模型中驗證Z01的成骨活性。最終證明Z01具有成骨活性，可以改善骨的微結構，增加骨密度，應用范圍極廣。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種具有成骨活性的氨基酸片段Z01及其篩選和應用。

背景技術

骨質疏松癥(Osteoporosis)是最常見的代謝性骨病，其特征是骨量減少、骨組織微結構改變、骨強度降低和骨折風險增加。骨質疏松是因為成骨細胞與破骨細胞之間功能不平衡造成的。調控骨形成和吸收關鍵通路機制的發現，有助確定具有特異作用機制的新治療方法。目前大多數骨質疏松治療藥物旨在抑制骨吸收，機制上針對破骨細胞。由于骨重建過程涉及骨形成和骨吸收，僅使用抗骨吸收類藥物難以有效改善骨量及骨結構，為了更有效治療骨質疏松，刺激新骨形成將是重要策略，機制上針對成骨細胞。市場上還沒有有效直接刺激新骨形成的藥物。而闡明骨形成過程的基因調控分子機制對指導骨質疏松特異性促骨形成新藥的研發有重要意義。

骨形成包括膜內成骨與軟骨內成骨兩種方式，膜內成骨是先由間充質細胞分化成為胚性結締組織膜，然后在此膜內成骨，顱面及鎖骨即以此方式發生；軟骨內成骨以預先形成的軟骨為模板然后被骨組織取代的過程為特征，遠較膜內成骨復雜，大多數骨如四肢、軀干及顱底骨以此方式發生。成骨細胞從間充質干細胞分化而來，經歷了由不同轉錄因子及信號蛋白調控的多個階段。Ihh是軟骨內成骨所必需的轉錄因子，不參與膜內成骨，它對間充質細胞分化為成骨細胞必不可缺；轉錄因子Runx2參與軟骨內成骨及膜內成骨調控，表達Runx2的細胞能分化為成骨細胞或軟骨細胞；成骨細胞特異轉錄因子Osterix(Osx)是骨形成及成骨細胞分化的必要轉錄因子，Osx基因缺失小鼠胚胎完全沒有骨形成而軟骨形成不受影響。我們課題組前期研究已經發現了一些重要的Osx下游靶基因，包括VDR，SatB2，VEGF，Dkk1，Sost等，進一步確認了Osx對骨形成的重要作用。Osx直接調控成骨細胞標志基因骨涎蛋白(Bsp)。全基因組關聯分析研究證實Osx與骨質疏松相關。雖然Osx與骨質疏松癥表型有關，但仍需進一步研究以確定Osx在骨形成作用的分子機制，包括探索Osx上游調節因子。骨質疏松迫切需要促骨形成新藥，而Osx作為骨分子開關是理想的全新靶點。

因此，開發一種促骨形成的新藥是本領域至關重要的，而Osx作為全新靶點，是新藥開發的關鍵突破口。

發明內容

針對現有技術普遍存在的問題，本發明提供了一種具有成骨活性的氨基酸片段Z01及其篩選和應用。本發明篩選出的Z01片段可以具有成骨活性，改善骨的微結構，增加骨密度。

本發明所述具有成骨活性的氨基酸片段Z01的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SCAPGADPKSRLCALCAGDDQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCL(SEQ ID NO.1)；

本發明還提供了一種所述具有成骨活性的氨基酸片段Z01的篩選過程，包括如下步驟：

S1、根據CL-XWY-012基因的結構及實驗需求，在CL-XWY-012基因的2號外顯子終止密碼子前敲入P2A-EGFP，以此作為靶點區域；

S2、采用PCR技術擴增靶點區域，并進行測序驗證，獲得擴增后的靶點區域；

S3、在靶點區域附近設計16條sgRNA，篩選活性高的2條sgRNA，同時經過酶切鑒定、測序構建打靶載體；