[發明專利]一種具有成骨活性的氨基酸片段Z01及其篩選和應用

在審

• 申請號: 202211520130.9
• 申請日: 2022-11-30
• 公開（公告）號: CN115785258A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 張馳
• 申請（專利權）人: 北京大學國際醫院
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C12N15/85;C12N15/65;A61K38/40;A61P19/10;C12Q1/02
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 徐翔

1.一種具有成骨活性的氨基酸片段Z01，其特征在于，所述氨基酸片段Z01的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種如權利要求1所述具有成骨活性的氨基酸片段Z01的篩選過程，其特征在于，包括以下步驟：

S1、根據CL-XWY-012基因的結構及實驗需求，在CL-XWY-012基因的2號外顯子終止密碼子前敲入P2A-EGFP，以此作為靶點區域；

S2、采用PCR技術擴增靶點區域，并進行測序驗證，獲得擴增后的靶點區域；

S3、在靶點區域附近設計16條sgRNA，篩選活性高的2條sgRNA，同時經過酶切鑒定、測序構建打靶載體；

S4、將步驟S3篩選得到的2條sgRNA，打靶載體電轉入C2C12細胞系中，經過藥物篩選、陽性克隆富集、PCR篩選，獲得陽性克隆CL-Osx-EGFP細胞株；

S5、將步驟S4獲得的陽性克隆CL-Osx-EGFP細胞株在DMEM培養液中培養，培養至60％-80％飽和時，用BMP2和Lactoferrin化合物進行藥物處理24小時，BMP2作為陽性對照，獲得經藥物處理的CL-Osx-EGFP細胞株；提取RNA，并反轉錄成cDNA，以合成的cDNA為模板，運用實時定量PCR技術對EGFP基因表達進行檢測，說明LF化合物是Osx的激活劑；

S6、下一步核實LF對Osx的激活作用：C2C12間充質干細胞在DMEM細胞培養液，在37℃、95％飽和濕度的濕化空氣中培養，將細胞置于6孔板中，培養至60％-80％飽和時，用LF處理24小時，經LF處理的C2C12細胞，提取RNA，并反轉錄成cDNA，以合成的cDNA為模板，運用實時定量PCR技術對Osx基因表達進行檢測，并進一步對LF的不同大小片段進行功能檢測、篩選，即獲得Z01。

3.如權利要求2所述的篩選過程，其特征在于，步驟S3所述篩選出的活性高的2條sgRNA為CL-XWY-012-sgRNA4和CL-XWY-012-sgRNA14。

4.如權利要求3所述的篩選過程，其特征在于，所述CL-XWY-012-sgRNA4對應的oligo序列如SEQ ID NO.2所示；所述CL-XWY-012-sgRNA14對應的oligo序列如SEQ ID NO.3所示。

5.如權利要求2所述的篩選過程，其特征在于，步驟S4所述的電轉過程采用細胞電穿孔法，是用短暫的高場強電脈沖處理細胞，沿細胞膜的電壓差異會讓電流

可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促，從而使外源DNA進入細胞膜內部。

6.如權利要求2所述的篩選過程，其特征在于，步驟S5和S6所述的DMEM培養液為含10％胎牛血清、100U/mL青霉素G鈉和100μg/mL硫酸鏈霉素的DMEM培養液。

7.一種如權利要求1所述的氨基酸片段Z01在制備具有成骨活性的藥物中的應用。

8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述藥物還包括生理鹽水及藥學上可接受的載體。

9.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述藥物劑型為注射劑、片劑、膠囊劑、口服液體劑型、微粒、軟膏劑中的一種。