[發明專利]一種促進體外培養細胞生成外泌體的培養基及其誘導方法

有效

• 申請號: 202211516071.8
• 申請日: 2022-11-30
• 公開（公告）號: CN115786254B
• 公開（公告）日: 2023-09-29
• 發明（設計）人: 李健;薛珂;馮婉怡;豐玫玫;王利群;楊宗繁;鄧智敏;曾勝
• 申請（專利權）人: 海南蘇生生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N13/00
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 文小花

1.一種促進體外培養細胞生成外泌體的培養基，其特征在于，每L培養基包括如下重量的組分：L-天冬酰胺7-8mg、L-谷氨酰胺360-370mg、D-葡萄糖900-1100mg、次黃嘌呤鈉1.5-3mg、亞油酸0.03-0.05mg、硫辛酸0.05-0.15mg、生物素0.003-0.004mg、氯化膽堿8-10mg、煙酰胺1.5-2.5mg、鹽酸吡哆醇1.5-2.5mg、腐胺0.07-0.09mg、丙酮酸鈉50-60mg、胸腺嘧啶0.3-0.5mg、碳酸氫鈉2300-2500mg、磷酸氫二鈉65-75mg、磷酸二氫鈉57-67mg、苯酚紅7-9mg、氯化物7400-7600mg、硫酸鹽45-55mg、硝酸鐵0.04-0.06mg、復合維生素15-25mg、復合氨基酸1000-1200mg、糖胺聚糖80-90mg和齊墩果酸60-65mg；

所述氯化物為氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀和氯化鈉；所述氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀和氯化鈉的質量比為232：28-30：310-312：6995-7000；

所述硫酸鹽為硫酸銅、硫酸鐵和硫酸鎂；所述硫酸銅、硫酸鐵和硫酸鎂的質量比為0.0013：0.415-0.420：48-49；

復合氨基酸為氨基酸鹽酸鹽、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸和纈氨酸；所述氨基酸鹽酸鹽、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸和L-纈氨酸的質量比為373-375：18-19：4-5：6-7：7-8：54-55：59-60：17-18：35-36：17-18：26-27：53-54：9-10：52-53；

所述氨基酸鹽酸鹽為L-精氨酸鹽酸鹽、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-胱氨酸二鹽酸鹽、L-組氨酸鹽酸鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽和L-酪氨酸二鈉鹽二水合物；所述L-精氨酸鹽酸鹽、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-胱氨酸二鹽酸鹽、L-組氨酸鹽酸鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽和L-酪氨酸二鈉鹽二水合物的質量比為147-148：17-18：31-32：31-32：91-92：55-56；

所述復合維生素為核黃素、d-泛酸鈣、葉酸、鹽酸硫胺素、肌醇和維生素B₁₂；所述核黃素、d-泛酸鈣、葉酸、鹽酸硫胺素、肌醇和維生素B₁₂的質量比為0.21-0.22：2.2-2.3：2.6-2.7：2.1-2.2：12-13：0.6-0.7；

所述的培養基用于體外培養細胞的誘導方法，包括如下步驟：

S1：取P3-P4代培養的臍帶間充質干細胞或骨髓間充質干細胞，待細胞融合度80%-90%時，換用所述的培養基，培養2-6d，收集培養上清液，過濾，得培養液；

所述培養2-6d的培養條件為：CO₂體積濃度4.5-5.5%、O₂體積濃度1-3%和余下體積濃度的N₂；

S2：將培養液加入至所述的培養基，培養1-2d，進行刺激培養2-3d后，梯度離心，收集外泌體，得外泌體；

所述培養1-2d的培養條件為：CO₂體積濃度4.5-5.5%、O₂體積濃度4-5%和余下體積濃度的N₂；所述刺激培養2-3d的培養條件為：CO₂體積濃度4.5-5.5%和余下體積濃度的N₂；

所述刺激培養為在細胞培養過程中進行重復磁刺激；所述重復磁刺激的條件為：頻率12-13?Hz、最大輸出強度30-32%、脈沖200-300個/12-16h。

2.根據權利要求1的一種促進體外培養細胞生成外泌體的培養基，其特征在于，每L所述培養基添加糖胺聚糖86mg和齊墩果酸63mg。

3.根據權利要求1的一種促進體外培養細胞生成外泌體的培養基，其特征在于，所述梯度離心為：10000-12000g離心10-15min，取上清液，過濾，100000-110000g離心90-100min。